Xác định hàm lượng thimerosal trong vắc xin và sinh phẩm (Phụ lục 15.29) – Dược Điển Việt Nam 5

Có nhiều phương pháp để xác định hàm lượng thimerosal trong vắc xin và sinh phẩm. Tùy theo khả năng hiện có về thiết bị và hóa chất tại cơ sở để chọn 1 trong 2 phương pháp thử nghiệm sau đây: Phương pháp hóa lý và phương pháp vi sinh vật.

Phương pháp hóa lý

Nguyên lý

Dựa vào phản ứng giải phóng ion thủy ngân tự do từ thimerosal, kết hợp với dithizon thành dithizon-thủy ngân, xác định bằng cách đo quang

Cách tiến hành

Làm song song 2 mẫu (mẫu vắc xin thử và mẫu chứng nước cất), lấy 0,2 ml mỗi mẫu cho vào từng bình nút mài riêng biệt có dung tích 100 ml.

Cho vào mỗi bình 1,2 ml acid sulfuric (TT) đã pha loãng 2 lần bằng nước cất 2 lần tính theo thể tích và đun nhẹ bình số 1 (chứa mẫu vắc xin thử) trong cách thủy cho đến khi tan hết. Thêm vào mỗi bình 5 ml dung dịch kali permanganat 5 % (TT), lắc đều và để yên trong 1h.

Loại bỏ kali permanganat thừa bằng cách thêm 1,5 ml dung dịch hydroxylamin clorid 10 % (TT), thêm 35 ml nước cất 2 lần, 5 ml dung dịch acid acetic 6 M (TT) và trộn đều. Dùng buret thêm chính xác vào mỗi bình 10 ml dung dịch dithizon 0,001 % và lắc 30 s.

Chuyển toàn bộ dung dịch thử của từng bình vào mỗi bình lắng gạn riêng biệt, tách lớp cloroform qua một lớp bông đã hấp và sấy khô vào các ống nghiệm. Đo độ hấp phụ ở bước sóng 620 nm (Phụ lục 4.1).

Hàm lượng thimerosal (X %) có trong vắc xin thử được tính theo công thức:

X = (a x 100 x 100)/(0,2 x 49,55 x 1000000) = a x 0,00101

Trong đó:

a là lượng thủy ngân (μg) xác định được theo đường chuẩn;

0,2 là số ml dung dịch vắc xin thử;

49,55 là hàm lượng thủy ngân có trong 100 phần của thimerosal;

100 là 100 phần thimerosal;

100 là đổi ra phần trăm;

1000000 là hệ số chuyển đổi từ μg sang g.

=> Đọc thêm: Xác định hàm lượng nhôm (Al+++) trong vắc xin và sinh phẩm (Phụ lục 15.27) – Dược Điển Việt Nam 5.

Cách dựng đường chuẩn

Cân chính xác 0,5 g thủy ngân, hòa vào 15 ml acid nitric (TT) và thêm nước cất vừa đủ 500 ml, được dung dịch thủy ngân có hàm lượng 1 mg/ml (DD*). Xác định hàm lượng thủy ngân như sau: Lấy 10 ml DD*, cho thêm 10 giọt dung dịch phèn sắt amoni 10 % và chuẩn độ từ từ với dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) cho đến khi xuất hiện màu da cam.

1 ml dung dịch amoni sulfocyanid 0,01 N (CĐ) tương đương với 0,001003 g thủy ngân.

Lấy 5 bình nút mài có dung tích 100 ml để tiến hành song song 5 thí nghiệm với 5 mẫu: 0,4 ml, 0,6 ml, 0,8 ml, 1,0 ml, 1,2 ml dung dịch thủy ngân chuẩn trên. Thêm vào mỗi bình 1,2 ml acid sulfuric (TT) đã pha loãng 2 lần bằng nước cất 2 lần và 30 ml nước cất 2 lần. Nếu không có nước cất 2 lần thì sử dụng nước xử lý dithizon như sau: Cho vào mỗi bình gạn 10 ml dung dịch dithizon (TT) (0,01 g/L), sau đó tách phần cloroform ra. Nếu màu của dithizon thay đổi thì làm đi làm lại vài lần cho đến khi màu của dithizon không thay đổi. Thêm 5 ml dung dịch natri clorid 0,9 % (TT) và 5 ml dung dịch acid acetic 6 M (TT) và tiến hành tiếp tục như đối với mẫu kiểm tra ghi ở phần trên. Các kết quả thu được cho phép lập một đường chuẩn về thủy ngân.

Cách pha dung dịch dithizon 0,001 %: Cân chính xác 10 mg dithizon (TT) hòa tan vào cloroform (TT) và thêm vừa đủ 100 ml với cùng dung môi.

Bảo quản dung dịch ở chỗ tối 4 °C đến 8 °C trong vòng 1 tháng. Trước khi dùng pha loãng 10 lần.

Phương pháp vi sinh vật

Nguyên lý

Phương pháp thực hiện dựa trên sự hình thành vòng ức chế sự phát triển của vi sinh vật được tạo bởi dung dịch thimerosal chuẩn và thimerosal có trong mẫu thử; so sánh đường kính vòng ức vô khuẩn.

Cách tiến hành

Pha thạch thường, đun nóng chảy hoàn toàn và đổ thạch dày 4 mm lên một phiến kính hình chữ nhật phẳng. Để thạch nguội hoàn toàn, đục lỗ thạch (đường kính 8 mm) sao cho khoảng cách giữa các lỗ thạch ít nhất là 30 mm. Cấy chủng Staphylococcus aureus trên thạch nghiêng, ủ ở 37 °C trong 18 h đến 24 h. Gặt và pha vi khuẩn bằng nước muối sinh lý vô khuẩn thành huyền dịch 10⁹ vi khuẩn/ml. Láng đều huyền dịch vi khuẩn (0,5 ml/đĩa thạch) trên đĩa thạch đã đục lỗ. Nhỏ vào mỗi lỗ 100 μl dung dịch thimerosal chuẩn nồng độ 1 g/L ở các độ pha loãng 1/2,5, 1/5, 1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160. Ủ ở 37 °C trong 24 h.

Đọc kết quả

Đo đường kính các vùng ức chế vi khuẩn mọc của các đậm độ thimerosal chuẩn, xây dựng đường chuẩn. Dựa vào đường chuẩn và đường kính vùng ức chế của vắc xin mẫu thử để tính ra hàm lượng thimerosal có trong vắc xin mẫu thử.

Tiêu chuẩn chấp thuận

Hàm lượng thimerosal trong mỗi vắc xin và sinh phẩm có thể khác nhau tùy theo yêu cầu cụ thể, nhưng không được thấp hơn hàm lượng cho thấy có khả năng kháng khuẩn và không cao hơn 115 % hàm lượng thimerosal ghi trên nhãn. Yêu cầu chung cho hàm lượng thimerosal trong các vắc xin và sinh phẩm có sử dụng thimerosal làm chất bảo quản đều không được vượt quá 0,02 % trừ khi có chỉ dẫn khác.

=> Xem thêm: Xác định hàm lượng phenol trong vắc xin và sinh phẩm (Phụ lục 15.28) – Dược Điển Việt Nam 5.