Xác định hàm lượng Saccharid tổng số bằng phương pháp Orcinol (Phụ lục 15.42) – Dược điển Việt Nam 5

Nguyên tắc

Phương pháp cho phép định lượng polyribosylribitol phosphat (PRP), polysaccharid này được xem là thành phần hoạt động chính của vắc xin Haemophilus influenza typ b. Phương pháp dựa trên sự hình thành phức hợp màu xanh và hòa tan trong nước.

Chuẩn bị dung dịch

Các dung dịch sau đây được pha ngay trước khi thử nghiệm.

Dung dịch chuẩn ribose: Hoà tan 5,0 mg ribose chuẩn trong bình định mức 10 ml bằng nước cất, thêm nước cất đến vạch. Lắc đều.

Dung dịch sắt (III) clorid trong acid hydrocloric: Cân 1 g sắt (III) clorid (TT) và hòa tan trong 10 ml nước cất. Pha 0,25 ml dung dịch thu được với 50 ml acid hydrocloric (TT).

Dung dịch orcinol: Cân 230 mg orcinol (TT) và hòa tan trong 5 ml ethanol (TT), chuẩn bị xong phải chứa dung dịch trong chai thủy tinh màu.

Dung dịch natri azid 0,02 %: Cân 0,02 g natri azid (TT) và pha loãng với 100 ml nước cất.

Chuẩn bị dung dịch để lập đường chuẩn: Từ dung dịch chuẩn ribose pha về các nồng độ 1 μg/ml, 4 μg/ml,12 μg/ml và 20 μg/ml.

Chuẩn bị mẫu kiểm tra:

Đối với mẫu cộng hợp (ARM): 50 μl mẫu pha loãng với  450 μl nước cất.

Nếu mẫu là sản phẩm cuối cùng thì không cần pha loãng.

Xem thêm: Xác định hàm lượng Cesi trong Vắc xin và Sinh phẩm (Phụ lục 15.41) – Dược điển Việt Nam 5

Tiến hành

Xác định hàm lượng saccharid tổng số

Lấy vào mỗi ống 500 μl dung dịch chuẩn ribose đã pha (nồng độ 1, 4, 12, 20 μg/ml).

Lấy 500 μl mẫu vắc xin cần kiểm tra vào một ống khác.

Thêm nước vào tất cả các ống để được 2000 μl.

Thêm 1000 μl dung dịch sắt (III) clorid trong acidhydrocloric vào các ống.

Thêm 80 μl dung dịch orcinol vào các ống.

Giữ 80 ° trong 5 min.

Để nguội, đo mật độ quang của các dung dịch ở 670 nm (OD 670 nm) và ở 580 nm (OD 580 nm) và tính kết quả.

Xác định hàm lượng saccharid tự do

Chú ý: Trước khi sử dụng ống ly tâm Centricon với màng lọc Ultracel YM-30, phải rửa ống ly tâm lại với nước và sau đó thêm 500 μl nước cất và ly tâm trong 5 min.

Thêm 500 μl mẫu vào phần trên của ống ly tâm Centricon.

Ly tâm ở 3500 r/min trong 20 min.

Sử dụng phần dịch được lọc ra (phần dịch nằm bên dưới) và tiến hành các bước theo phần xác định hàm lượng saccharid tổng số.

Rửa hệ thống ống ly tâm Centricon với màng lọc Ultracel YM-30 bằng nước và thêm dung dịch natri azid 0,02 %.

Bảo quản ở 4 °C cho đến khi dùng trở lại.

Xem thêm: Xác định hàm lượng Lipid trong Vắc xin và Sinh phẩm (Phụ lục 15.40) – Dược điển Việt Nam 5

Tính hàm lượng saccharid cuối cùng của mẫu thử (C_f) theo công thức sau:

C_f = C_m x 10^-3 x 2,45

Trong đó:

C_m là giá trị trung bình của hàm lượng ribose trong mẫu thử;

2,45 là hệ số biểu hiện mọi tương quan về khối lượng phân tử của polymer (saccharid) và D-ribose;

10^-3 là hệ số chuyển đổi từ đơn vị μg/ml thành mg/ml.

Kết quả được tính theo đơn vị mg/ml (mg carbonhydrat/ml mẫu cần kiểm tra).