ĐỊNH LƯỢNG ACID OMEGA-3 TRONG DẦU CÁ (Phụ lục 10.21) – Dược điển Việt Nam 5
Nếu nội dung bài viết chưa chính xác, vui lòng thông báo cho chúng tôi tại đây
Th8
Dầu cá là sản phẩm có nguồn gốc từ các loài cá thuộc họ Cá trồng (Engraulidae), Cá khế (Carangidae), Cá trích (Clupeidae), Cá ốt me (Osmeridae), Cá Hồi (Salmonidae), Cá ngừ (Scombridae). Dầu cá có chứa acid omega-3. Acid omega-3 bao gồm acid alpha-linolenic (C18:3 n-3), acid moroctic (C18 :4 n-3), acid cicosatetraenoic (C20:4 n-3), acid timnodonic (eicosapentaenoic) (C20:5 n-3; EPA), acid heneicosapentaenoic (C21:5 n-3), acid clupanodonic (C22:5 n-3) và acid cervonic (docosahexaenoic) (C22:6n-3; DHA).
EPA và DHA
Phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2).
Quá trình xử lý mẫu cần được tiến hành nhanh, tránh tiếp xúc với ánh sáng, các tác nhân oxy hóa, chất xúc tác quá trình oxy hóa (ví dụ: đồng, sắt) và không khí.
Phương pháp được áp dụng để phân tích dạng methyl hoặc ethyl ester của acid (all-Z)-eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoic (EPA; 20:5 n-3) và acid (all-Z)-docosa-4,7,10,13,16,19- hexaenoic (DHA; 22:6 n-3).
Chuẩn nội: Methyl tricosanoat (TT).
Dung dịch thử (a)
A. Áp dụng với chế phẩm chứa acid omega-3 ở dạng ethyl ester: Hòa tan một lượng chế phẩm tương ứng trong Bảng 1 và khoảng 70,0 mg chuẩn nội bằng dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT) và pha loãng thành 10,0 ml với cùng dung môi. Có thể đun nóng nhẹ (tới 60 °C) để hòa tan chuẩn nội.
Bảng 1 – Khối lượng mẫu chế phẩm dùng thử nghiệm
| Tổng hàm lượng EPA và DHA (%) | Khối lượng mẫu chế phẩm dùng thử nghiệm (g) |
| 30-50 | 0,4-0,5 |
| 50-70 | 0,3 |
| 70-90 | 0,25 |
B. Áp dụng với chế phẩm chứa acid omega-3 ở dạng triglycerid: Lấy 2,0 ml dung dịch thu được ở phép thử A vào ống thủy tinh thạch anh có nắp xoáy dung tích thích hợp, bay hơi dung môi đến khô dưới dòng khí nitrogen (TT). Thêm 1,5 ml dung dịch natri hydroxyd (TT) 2 % trong methanol (TT), thổi khí nitrogen, nắp kín bằng nắp đậy có bao lớp polytetrafluoroethylen, lắc đều. Đun trên cách thủy trong 7 min, để nguội. Thêm 2 ml dung dịch boron triclorid trong methanol (TT), thổi khí nitrogen (TT), nắp kín, lắc nhẹ. Đun trên cách thủy trong 30 min. Để nguội tới 40 – 50°C, thêm 1 ml trimethylpentan (TT), nắp kín, lắc mạnh ít nhất 30 s. Ngay lập tức, thêm 5 ml dung dịch natri clorid bão hòa (TT), thổi khí nitrogen (TT), nắp kín, lắc kỹ trong ít nhất 15 s, ly tâm 3000 r/min trong 5 min, hoặc để tách lớp. Chuyển lớp trimethylpentan (lớp trên) sang lọ thủy tinh khác, phần còn lại (lớp dưới) được chiết với 1 ml trimethylpentan (TT) thêm một lần nữa. Gộp các dịch chiết trimethylpentan. Rửa dịch chiết trimethylpentan với nước hai lần, mỗi lần 1 ml, sau đó làm khô dịch chiết trimethylpentan bằng natri sulfat khan (TT) được dung dịch tiêm sắc ký. Chuẩn bị 3 dung dịch thử
Dung dịch thử (b): Hòa tan 0,300 g chế phẩm bằng dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT) và pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi. Tiếp tục các bước tương tự như chuẩn bị dung dịch thử (a).
Dung dịch đối chiếu (a1): Hòa tan khoảng 70,0 mg chuẩn nội và 90,0 mg acid eicosapentacnoic ethyl ester chuẩn trong dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT), pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi. Có thể đun nóng nhẹ (tới 60 °C) để hòa tan chuẩn nội
Dung dịch đối chiếu (a2): Hòa tan khoảng 60,0 mg acid docosahexaenoic ethyl ester chuẩn và 70,0 mg chuẩn nội trong dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT), pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi. Có thể đun nóng nhẹ (tới 60 °C) để hòa tan chuẩn nội.
Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (a1) và (a2) theo các bước như mô tả tại mục A của phần Dung dịch thử (a) nếu kiểm tra chế phẩm chứa acid omega-3 ở dạng ethyl este; tiếp tục theo các bước mô tả tại mục B của phần Dung dịch thử (a) nếu chế phẩm chứa acid omega-3 ở dạng triglycerid.
Chuẩn bị 3 dung dịch đối chiếu đối với mỗi mẫu chế phẩm cần kiểm tra.
Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan 0,3 g methylpalmitat (TT), 0,3 g methyl stearat (TT), 0,3 g methyl arachidat (TT) and 0,3g methyl behenat (TT) trong dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT), pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi.
Dung dịch đối chiếu (c): Hòa tan khoảng 55,0 mg acid docosahexaenoic methyl ester (TT) và khoảng 5,0 mg acid tetracos-15-enoic methyl ester (TT) trong dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT), pha loãng thành 10,0 ml bằng cùng dung môi.
Điều kiện sắc ký
Cột mao quản bằng silica nung chảy, chiều dài ít nhất 25 m, đường kính 0,25 mm. được phủ lớp phim macrogol 20000 dày 0,2 μm.
Khí mang: Hydrogen (TT) hoặc heli dùng cho sắc ký khí (TT).
Tốc độ dòng: 1,0 ml/min.
Detector ion hóa ngọn lửa
Thể tích tiêm: 1 μl tiêm 2 lần.
Tỷ lệ chia dòng 1: 200. Nếu hệ thống sắc ký sử dụng chế độ không chia dòng, các dung dịch thử và đối chiếu phải được pha loãng 200 lần bằng dung dịch butylhydroxytoluen (TT) 0,005 % trong trimethylpentan (TT) trước khi tiêm sắc ký.
Chương trình nhiệt độ:
| Thời gian (min) | Nhiệt độ (oC) | |
| Cột | 0-2 | 170 |
| 2-25,7 | 170-240 | |
| 25,7-28 | 240 | |
| Buồng tiêm | 250 | |
| Detector | 270 |
Tính phù hợp hệ thống:
Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (b), phần trăm diện tích của các pic tăng dần tương ứng với các chất sau: methyl palmitat, methyl stearat, methyl arachidat, methyl behenat. Phần trăm diện tích của pic methyl palmitat và pic methyl behenat khác nhau không quá 2,0 %.
Độ phân giải: Trên sắc ký đồ thu được của dung dịch đối chiếu (c), độ phân giải giữa pic của acid docosahexaenoat methyl ester và acid tetracos-15-enoic methyl ester không nhỏ hơn 1,2.
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử (a), pic của methyl tricosanoat và bất kỳ pic của acid hencicosapentaenoic methyl ester hoặc ethyl ester (C21:5) khi so sánh với sắc ký đồ của dung dịch thử (b) phải cho thấy sự tách biệt rõ (nếu không phải dùng hệ số hiệu chỉnh).
Tính hàm lượng phần trăm của EPA và DHA theo công thức sau:
(A x Ax,3 x m1 x mx,r x l x C x 100)/ (mx,3 x A1 x Ax,r x m2)
Trong đó:
m1 là khối lượng chuẩn nội trong dung dịch thử (a), tính bằng mg,
m2 là khối lượng chuẩn nội trong dung dịch thử (a), tính bằng mg,
mx,3 là khối lượng chuẩn nội trong dung dịch đối chiếu (a1) (định lượng EPA) hoặc trong dung dịch đối chiếu (a2) (định lượng DHA), tính bằng mg;
mx,r là khối lượng acid eicosapentaenoic ethyl ester chuẩn trong dung dịch đối chiếu (a1) hoặc acid docosahexaenoic ethyl ester chuẩn trong dung dịch đối chiếu (a2), tính bằng mg;
Ax là diện tích pic của acid eicosapentaenoic ester hoặc acid docosahexaenoic ester trong sắc ký đồ của dung dịch thử (a);
Ax,r là diện tích pic của acid eicosapentaenoic ester trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a1) hoặc acid docosahexaenoic ester trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a2);
A1 là diện tích pic chuẩn nội trong sắc ký đồ của dung dịch thử (a);
Ax,3 là diện tích pic chuẩn nội trong sắc ký đồ dụng của dịch đối chiếu (a1) (định lượng EPA) hoặc trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a2) (định lượng DHA);
C là hệ số chuyển đổi giữa dạng ethyl ester và dạng triglycerid: C = 1,00 đối với ethyl ester; C = 0,954 đối với EPA; C = 0,957 đối với DHA.
Acid omega-3 toàn phần
Xem sắc ký đồ của acid omega-3 toàn phần trong dầu cá trong Hình 10.21.
Từ kết quả định lượng EPA và DHA, tính hàm lượng phần trăm của acid omega-3 toàn phần theo công thức sau:
EPA+DHA+[An-3(EPA+DHA)]/ (АЕРА + АDHA)
Trong đó:
EPA là hàm lượng phần trăm của EPA;
DHA là hàm lượng phần trăm của DHA,
An-3 tổng diện tích của các pic C18:3 n-3, C18:4 n-3, C20:4 n-3, C21:5 n-3 and C22:5 n-3 ester trong sắc ký đồ của dung dịch thử (b);
AEPA là diện tích pic của EPA ester trong sắc ký đồ của dung dịch thử (b);
ADHA là diện tích pic của DHA ester trong sắc ký đồ của dung dịch thử (b).
