ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN D (Phụ lục 10.22) – Dược điển Việt Nam 5

Hoạt lực của vitamin D được tính theo đơn vị quốc tế (ký hiệu IU). 1 IU vitamin D tương đương với 0,025 μg ergocalciterol hoặc cholecalciferol.
Quy trình định lượng vitamin D cần được tiến hành nhanh, hạn chế tối đa tiếp xúc với không khí và ánh sáng, tốt hơn hết là sử dụng sự che phủ của khí trơ và thủy tinh màu.

Phương pháp 1: Phương pháp sắc ký lỏng

Quy trình sắc ký lỏng sau đây được áp dụng cho định lượng vitamin D dưới dạng ergocalciferol hoặc cholecalciferol trong các chế phẩm thuốc đa vitamin.

Hóa chất và thuốc thử đặc biệt

Ether (TT₁): Ether (TT) được sử dụng trong vòng 24 h sau khi mở lọ.
Hexan khan (TT₁): Được điều chế bằng sắc ký cột hấp phụ. Chuẩn bị cột sắc ký (60 cm x 8 cm) nhồi 500 g đất silic dùng cho sắc ký (50 – 250 μm) (TT) đã được hoạt hóa bằng cách sấy ở 150 °C trong 4 h. Cho 500 ml hexan (TT) qua cột và hứng dịch rửa giải vào bình nón nút mài.
Dung dịch butyl hydroxytoluen (TT): Hòa tan 1,0 g butylhydroxytoluen (TT) trong ether dầu hỏa tinh khiết sắc ký (TT) vừa đủ 100 ml.
Dung dịch kali hydroxyd (TT₁): Hòa tan 50,0 g kali hydroxyd (TT) trong 50,0 ml nước vừa đun sôi, lắc đều và để nguội. Pha mới dung dịch hàng ngày.
Dung dịch kali hydroxyd trong ethanol 96 % (TT₁): Hòa tan 3 g kali hydroxyd (TT) trong 50 ml nước vừa đun sôi, thêm 10 ml ethanol 96 % (TT), pha loãng thành 100 ml với nước vừa mới đun sôi, lắc đều và để nguội. Pha mới dung dịch hàng ngày.
Dung dịch natri ascorbat (TT): Hòa tan 3,5 g acid ascorbic (TT) trong 20 ml dung dịch natri hydroxyd 1 N (TT). Pha mới dung dịch hàng ngày.
Dung dịch natri sulfid (TT₁): Hòa tan 12 g natri sulfid (TT) trong 20 ml nước, pha loãng thành 100 ml bằng glycerin (TT) và lắc đều.

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3).

Pha động:
Pha động A: Hỗn hợp acetonitril – methanol – nước (25 : 25 : 1). Lượng nước và tốc độ dòng có thể thay đổi để đáp ứng yêu cầu của độ thích hợp hệ thống.
Pha động B: Hỗn hợp alcol n-amylic – hexan khan (3 : 997). Tỷ lệ các thành phần và tốc độ dòng có thể thay đổi để đáp ứng yêu cầu của độ thích hợp hệ thống.
Dung dịch chuẩn nội: Cân chính xác 15 mg A^4,6-cholestadienol chuẩn vào bình định mức dung tích 200 ml, thêm hỗn hợp toluen – pha động B (10 : 90) đến vạch và lắc đều.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg ergocalciferol chuẩn hoặc cholecalciferol chuẩn vào bình định mức dung tích 50 ml, hòa tan không làm nóng trong toluen (TT), pha loãng đến vạch với cùng dung môi và lắc đều. Lấy 10 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức dung tích 100 ml, pha loãng đến vạch với toluen (TT) và lắc đều. Pha mỗi dung dịch chuẩn gốc hàng ngày.
Dung dịch thử:
Đối với dung dịch dầu: Cân chính xác một lượng chế phẩm (không ít hơn 0,5 g) tương ứng với khoảng 125 μg (5000 IU) cholecalciferol hoặc ergocalciferol. Thêm 1 ml dung dịch natri ascorbat (TT), 25 ml ethanol 96 % (TT) và 2 ml dung dịch kali hydroxyd (TT) và lắc đều.
Đối với viên nang và viên nén: Đun hồi lưu trên cách thủy không ít hơn 10 viên nang hoặc viên nén với hỗn hợp gồm 10ml dung dịch natri ascorbat (TT) và 2 giọt dung dịch natri sulfid (TT) trong 10 min, nghiền những mẩu rắn còn lại bằng đũa thủy tinh đầu tù và tiếp tục đun nóng trong 5 min. Làm mát, thêm 25 ml ethanol 96 % (TT), 3 ml dung dịch kali hydroxyd (TT) và lắc đều.
Đối với chế phẩm khô và chế phẩm phân tán trong nước: Cân chính xác một lượng chế phẩm (không quá 0,5 g) tương ứng với khoảng 125 μg (5000 IU) cholecalciferol hoặc ergoealciferol. Thêm từng lượng nhỏ kèm theo lắc tròn nhẹ nhàng 25 ml ethanol 96 % (TT), 5 ml dung dịch natri ascorbat (TT) và 3 ml dung dịch kali hydroxyd (TT).
Tiến hành xà phòng hóa và chiết: Đun hồi lưu hỗn hợp được chuẩn bị từ chế phẩm trên cách thủy trong 30 min. Làm lạnh nhanh dưới vòi nước và chuyển hỗn hợp đã được xà phòng hóa vào bình gạn, tráng bình nón dùng để xà phòng hóa lần lượt với: 2 lần, mỗi lần 15 ml nước, 10 ml ethanol 96 % (TT): 2 lần, mỗi lần 50 ml ether (TT). Chuyển toàn bộ dịch rửa vào bình gạn trên và lắc mạnh trong 30 s, để yên tới khi cả hai lớp trong. Chuyển lớp nước vào bình gạn thứ hai, thêm hỗn hợp 10 ml ethanol 96 % (TT) và 50 ml ether dầu hỏa (TT) và lắc mạnh. Để tách lớp và chuyển lớp nước vào bình gạn thứ ba, chuyển lớp ether dầu hỏa vào bình gạn thứ nhất, tráng bình gạn thứ hai bằng ether dầu hỏa (TT) 2 lần, mỗi lần 10 ml, chuyển dịch rửa vào bình gạn thứ nhất. Lắc lớp nước ở bình gạn thứ ba với 50 ml ether dầu hỏa (TT) và chuyển lớp ether dầu hỏa vào bình gạn thứ nhất. Rửa toàn bộ dịch chiết ether – ether dầu hỏa với dung dịch kali hydroxyd trong ethanol 96 % (TT) 3 lần, mỗi lần 50 ml và tiếp tục rửa bằng lắc mạnh với nước mỗi lần 50 ml tới khi nước rửa trung tính với phenolphthalein (TT). Làm kiệt những giọt nước còn lại của dịch chiết ether – ether dầu hỏa, thêm 2 miếng giấy lọc đường kính 9 cm, cắt thành dải vào bình gạn và lắc. Chuyển dịch chiết ether – ether dầu hỏa vào bình cầu đáy tròn, rửa bình gạn và giấy lọc bằng ether dầu hỏa (TT). Gộp dịch rửa ether dầu hỏa với dịch chiết ether – ether dầu hỏa, thêm 5,0 ml dung dịch chuẩn nội và 100 μl dung dịch butyl hydroxytoluen (TT) và lắc đều. Bốc hơi đến khô bằng cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C. Làm mát dưới vòi nước và đưa nitrogen vào đủ để phục hồi áp suất không khí. Hòa tan ngay cắn trong 5 ml hỗn hợp methanol – acetonitril (1 : 1) hoặc trong một thể tích chính xác của hỗn hợp methanol – acetonitril (1 : 1) để thu được dung dịch thử có nồng độ Vitamin D là 25 μg /ml.

Điều kiện sắc ký:
Cột làm sạch: Cột kích thước (30 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 μm hoặc 10 μm) sử dụng pha động A.
Cột phân tích: Cột kích thước (25 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh A (5 μm hoặc 10 μm) sử dụng pha động B.
Tốc độ dòng: 1 ml/min.
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 254 nm.

Cách tiến hành:

Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống đối với cột làm sạch: Lấy chính xác 5,0 ml dung dịch chuẩn vào bình cầu đáy tròn nối với ống sinh hàn hồi lưu, thêm 2 hoặc 3 tinh thể butyl hydroxytoluen (TT). Thay thế không khí bằng nitrogen, đun nóng trong cách thủy duy trì ở nhiệt độ 90 °C trong ánh sáng dịu dưới khí nitrogen trong 45 min để thu được dung dịch có chứa vitamin D và tiền vitamin D. Làm lạnh và thêm 10,0 ml dung dịch chuẩn nội, lắc đều và bốc hơi bằng cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C. Làm lạnh dưới vòi nước và đưa nitrogen vào đủ để phục hồi áp suất không khí. Hòa tan ngay cắn trong 10 ml hỗn hợp methanol – acetonitril (1 : 1) và lắc đều.
Tiêm 500 μl dung dịch này vào cột làm sạch. Sắc ký đồ có một pic có thời gian lưu khoảng 5 min đến 9 min tương ứng với pic của hỗn hợp gồm vitamin D, tiền vitamin D và Δ^4,6-cholestadienol được tách khỏi các chất khác. Điều chỉnh tỉ lệ nước hoặc tốc độ dòng nếu cần (xem pha động A).
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống đối với cột phân tích:
Cân khoảng 100 mg chất chuẩn thử độ thích hợp hệ thống của định lượng vitamin D vào bình định mức dung tích 100 ml, hòa tan và pha loãng đến vạch bằng hỗn hợp toluen – pha động B (5 : 95) và lắc đều. Đun hồi lưu một phần dung dịch này ở 90 °C trong 45 min và làm lạnh, thu được dung dịch thử độ thích hợp hệ thống của cột phân tích.
Tiêm dung dịch thử độ thích hợp hệ thống của cột phân tích 5 lần: Thời gian lưu tương đối là khoảng 0,4 với pre-cholecalciferol, 0,5 với trans-cholecalciferol và 1,0 với cholecalciferol. Độ phân giải giữa pic trans-cholecalciferol và pre-cholecalciferol không nhỏ hơn 1,0 và độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng pic cholecalciferol không quá 2,0 %.
Hiệu chuẩn hệ số đáp ứng của vitamin D: Lấy chính xác 4,0 ml dung dịch chuẩn và 10,0 ml dung dịch chuẩn nội vào bình định mức dung tích 100 ml, pha loãng đến vạch với pha động B và lắc đều để thu được dung dịch chuẩn làm việc. Bảo quản dung dịch chuẩn làm việc ở nhiệt độ không quá 0 °C (giữ phần chưa dùng cho tiến hành định lượng).
Tiêm 200 μl dung dịch chuẩn làm việc vào cột phân tích và đo đáp ứng pic của vitamin D và Δ^4,6-cholestadienol. Thời gian lưu tương đối của Δ^4,6-cholestadienol là khoảng 1,3.

Tính toán hệ số đáp ứng, F_D, bằng công thức sau:

F_{D =} C_s / (R_S x C_R)

Trong đó:
C_s và C_R là nồng độ tương ứng của vitamin D và Δ^4,6-cholestadienol trong dung dịch chuẩn làm việc (μg/ml).
R_S là tỉ số đáp ứng pic của vitamin D đối với Δ^4,6-cholestadienol.
Hiệu chuẩn hệ số đáp ứng của tiền vitamin D: Lấy chính xác 4 ml dung dịch chuẩn vào bình cầu đáy tròn nối với ống sinh hàn hồi lưu, thêm 2 hoặc 3 tinh thể butyl hydroxytoluen (TT). Thay thế không khí bằng nitrogen, đun nóng trong cách thủy duy trì ở nhiệt 90 °C trong ánh sáng dịu và dưới khí nitrogen trong 45 min để thu được dung dịch có chứa vitamin D và tiền vitamin D. Làm mát và sử dụng pha động B để chuyển toàn bộ dung dịch trên vào bình định mức dung tích 100 ml có chứa 10,0 ml dung dịch chuẩn nội, pha loãng đến vạch với pha động B và lắc đều, thu được dung dịch hỗn hợp làm việc.
Tiêm 200 μl dung dịch hỗn hợp làm việc vào cột phân tích và đo đáp ứng pic của vitamin D, tiền vitamin D và Δ^4,6-cholestadienol. Tính toán nồng độ C’s (μg/ml) của vitamin D trong dung dịch hỗn hợp làm việc (đã đun nóng) bằng công thức:

C’_s – F_D x C_R x R’_s

Trong đó:
C_R là nồng độ của Δ^4,6-cholestadienol (μg/ml),
R’_s là tỉ số đáp ứng pic của vitamin D đối với Δ^4,6-cholestadienol.

Tính toán nồng độ, C’_PRE (μg/ml), của tiền vitamin D trong dung dịch hỗn hợp làm việc bằng công thức:

C_PRE = C_S – C’_s

Tính toán hệ số đáp ứng, F_PRE , đối với tiền vitamin D bằng công thức:

F_PRE = (F_D x R’_s x C’_PRE )/ (R’_PRE x C’_s)

Trong đó:
R’_PRE là tỉ số đáp ứng pic của tiền vitamin D đối với Δ^4,6-cholestadienol.
(Chú ý: Giá trị của F_PRE được xác định trùng lặp ở những ngày khác nhau có thể sử dụng trong cả quy trình này).
Tiến hành sắc ký: Tiêm 500 μl dung dịch thử vào cột làm sạch và lấy phần rửa giải trong khoảng thời gian tương ứng 0,7 đến 1,3 thời gian lưu tương đối của pic vitamin D hỗn hợp (xem phần thử độ thích hợp hệ thống của cột làm sạch) vào một bình cầu đáy tròn. Thêm 50 μl dung dịch butyl hydroxytoluen (TT), lắc đều và bay hơi trong chân không đến khô bằng cắt quay chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C. Làm mát dưới vòi nước và đưa nitrogen vào đủ để phục hồi áp suất không khí. Hòa tan ngay cắn trong 5,0 ml hỗn hợp toluen – pha động B (5 : 95). Tiêm 200 μl dung dịch này vào cột phân tích và đo đáp ứng píc của vitamin D, tiền vitamin D và Δ^4,6-cholestadienol. Tính toán nồng độ của cholecalciferol (C₂₇H₄₄O) hoặc ergocalciferol (C₂₈H₄₄O) bằng công thức sau:

(R”_D x F_D + R” _PRE x F_PRE) x C”_R

Trong đó:
R”_D là tỉ số của đáp ứng pic của vitamin D đối với Δ^4,6-cholestadienol;
R” _PRE là tỉ số đáp ứng pic của tiền vitamin D đối với Δ^4,6 -cholestadicnol;
C”_R là nồng độ của Δ^4,6 -cholestadienol trong dung dịch thử (μl/ml).

Phương pháp 2: Phương pháp hóa học

Quy trình sau đây được áp dụng cho định lượng vitamin D trong các chế phẩm thuốc.

Hóa chất và thuốc thử đặc biệt

Đất sét dùng cho sắc ký (TT₁): Đất sét dùng cho sắc ký (TT) có hàm lượng nước từ 8,5 % đến 9,0 % (sử dụng phương pháp mất khối lượng do làm khô).
Ether dầu hỏa (TT₁): Dùng ether dầu hỏa (TT), nếu cần chưng cất lại, đáp ứng thêm yêu cầu sau đây:
Tinh khiết quang phổ: Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) của chế phẩm ở bước sóng 300 nm, dùng không khí làm mẫu trắng, độ hấp thụ không được quá 0,070.
Ethylen clorid (TT₁): Ethylen clorid (TT) tinh chế qua cột silica gel (74 μm đến 850 μm).
Dung dịch butyl hydroxytoluen (TT₁): Hòa tan 10 mg butyl hydroxytoluen (TT) trong 100 ml ethanol 96 % (TT). Pha mới dung dịch hàng ngày.
Ether (TT₂): Sử dụng ether (TT) mới cất, bỏ đi 10 % dịch cất đầu và cuối.

Thuốc thử tạo màu

Dung dịch A : Chuyển hết toàn hộ 113 g antimony triclorid (TT) tinh thể khô có chứa sẵn trong lọ mới chưa mở vào bình nón có chứa 400 ml ethylen florid (TT). Thêm khoảng 2 g nhôm oxyd khan (TT), lắc đều và lọc qua giấy lọc vào bình định mức thủy tinh trong, dung tích 500 ml.
Pha loãng thành 500 ml với ethylen clorid (TT) và lắc đều. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1 ) của dung dịch này ở bước sóng 500 nm, trong cốc đo 20 mm, dùng dung dịch ethylen clorid (TT) làm mẫu trắng, độ hấp thụ đo được không được quá 0,070.
Dung dịch B: Lắc đều trong hết 100 ml acetyl florid (TT) với 400 ml ethylen clorid (TT).
Thuốc thử tạo màu: Lắc đều 45 ml dung dịch A và 5 ml dung dịch B. Bảo quản trong lọ kín và sử dụng được trong vòng 7 ngày, nhưng nếu thuốc thử xuất hiện màu thì bỏ đi.

Phương pháp sắc ký cột

Chuẩn bị các cột sắc ký:
– Cột thứ nhất: Chuẩn bị sắc ký cột đi xuống gồm một cột sắc ký có đường kính trong 2,5 cm và dài khoảng 25 cm và được thu nhỏ lại tới đường kính 8 mm trong khoảng cách 5 cm từ đầu cuối của ống, đặt một đĩa thủy tinh xốp có lỗ xốp lớn hoặc một miếng nhỏ bông thủy tinh ngay trên điểm thắt này. Phần thu nhỏ này có thể lắp một khóa nhựa bên trong.
Cho khoảng 125 ml isooctan (TT) vào một chai miệng rộng, nút xoáy, thêm 25 g đất Silic dùng cho sắc ký (TT), lắc đến khi tạo thành bột nhão. Thêm từng giọt và lắc đều mạnh 10 ml polyethylen glycol 600 (TT). Đậy nút chai và lắc mạnh trong 2 min. Rót một nửa lượng bột nhão vào cột sắc ký và để lắng. Sau đó áp dụng hút chân không nhẹ nhàng và thêm phần còn lại của bột nhão (thêm từng phần nhỏ một), nhồi từng phần bằng một ống pit tông hình đĩa 20 nm. Khi bề mặt rắn bình thành, bỏ chân không và thêm khoảng 2 ml isooctan (TT).

– Cột thứ hai: Chuẩn bị một cột gồm ba phần: (1) Phần đầu phình rộng có đường kính trong 18 nm và dài khoảng 14 cm; (2) Phần giữa có đường kính trong 6 mm và dài khoảng 25 cm và (3) Phần ống ra phía dưới được thu nhỏ lại, dạng hình phễu, dài khoảng 5 cm. Đặt một miếng bông thủy tinh nhỏ phía trên phần thu nhỏ 1 cm.
Nhồi vào phần giữa của ống 3 g đất sét dùng cho sắc ký (TT) với hút chân không nhẹ nhàng (khoảng 125 mm thủy ngân).
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25 mg ergocalciferol chuẩn hoặc cholecalciferol chuẩn vào bình định mức dung tích 100 ml, hòa tan trong isooctan (TT), pha loãng đèn vạch bằng cùng dung môi và lắc đều. Bảo quản dung dịch này trong tủ lạnh. Khi định lượng, hút 1,0 ml dung dịch này vào bình định mức dung tích 50 ml, bốc hơi dung môi bằng dòng khí nitrogen, hòa tan cắn và pha loãng đến thể tích với ethylen clorid (TT) và lắc đều.
Dung dịch thử: Cân hoặc hút chính xác một lượng chế phẩm tương đương với không ít hơn 125 μg nhưng thích hợp nhất là 250 μg ergocalciferol (10000 IU). Nếu ít hoặc không có vitamin A có mặt trong chế phẩm, thêm khoảng 1,5 mg Vitamin A acetat (tương đương với 3000 IU) để tạo các dải thực nghiệm cần thiết trong phần sắc ký phía sau.
Đối với viên nang hoặc viên nén, đun hồi lưu ít nhất 10 viên trong 10 ml nước trên cách thủy khoảng 10 min, nghiền chất rắn còn lại bằng đũa thủy tinh đầu tù và đun nóng thêm 5 min.
Thêm một thể tích dung dịch kali hydroxid 50 % (TT) tương ứng với 2,5 ml cho mỗi g của khối lượng chế phẩm, nhưng tổng thể tích không ít hơn 3,0 ml. Thêm 10 ml dung dịch butyl hydroxytoluen (TT) và 20 ml dung dịch ethanol 96 % (TT). Đun hồi lưu mạnh trên cách thủy khoảng 30 min. Làm mát và chuyển hỗn hợp xà phòng hóa vào một bình gạn, rửa bình nón xà phòng hóa 3 lần, mỗi lần 10 ml nước và 3 lần, mỗi lần 50 ml ether (TT), gộp dịch rửa vào bình gạn. Thêm khoảng 4 g natri sulfat decahydrat (TT) vào bình gạn và chiết bằng cách lắc trong 2 min. Nếu hình thành nhũ dịch, chiết 3 lần mỗi lần 25 ml ether (TT). Gộp dịch chiết ether và rửa nhẹ nhàng với 50 ml nước. Rửa nhắc lại nhiều lần bằng cách lắc mạnh, mỗi lần với 50 ml nước đến khi dịch rửa cuối cùng không có màu hồng khi thêm dung dịch phenolphthalein (TT). Chuyển dịch chiết ether đã rửa vào bình định mức dung tích 250 ml, pha loãng đến thể tích với ether (TT) và lắc đều. Chuyển toàn bộ dung dịch hoặc lấy một thể tích chính xác có chứa khoảng 250 μg ergocalciferol vào cốc có mỏ cao thành dung tích 400 ml có chứa 5 g natri sulfat khan (TT). Khuấy trong 2 min, gạn phần dung dịch vào cốc có mỏ dung tích 400 ml khác. Rửa phần natri sulfat còn lại 3 lần, mỗi lần 25 ml ether (TT), gộp dịch rửa vào phần dung dịch. Bốc hơi trên cách thủy đến khi còn khoảng 30 ml, chuyển vào một bình cầu bốc hơi đáy tròn, nhỏ. Rửa cốc 3 lần mỗi lần 10 ml ether (TT), gộp dịch rửa vào bình cầu. Bốc hơi bằng cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C hoặc bằng dòng khí nitrogen ở nhiệt độ phòng để loại bỏ hoàn toàn dung môi. Hòa tan cắn trong một lượng nhỏ ether dầu hỏa (TT), chuyển vào bình định mức dung tích 10 ml, pha loãng đến thể tích với ether dầu hỏa (TT), lắc đều thu được dung dịch thử.

Cách tiến hành:

– Sắc ký cột thứ nhất: Ngay khi 2 ml isooctan (TT) thấm hết vào trong bề mặt của cột thứ nhất, hút 2 ml dung dịch thử lên bề mặt cột. Khi mặt lõm của dung dịch thử đi tới bề mặt cột, thêm lần đầu tiên của 3 lần thêm, mỗi lần 2 ml ether dầu hỏa (TT), mỗi lần thêm tiếp theo khi lần thêm trước thấm hết vào trong cột. Tiếp tục thêm ether dầu hỏa (TT) nhiều lần, mỗi lần 5 đến 10 ml tới khi thêm được 100 ml. Nếu cần điều chỉnh tốc độ dòng từ 3 đến 6 ml/min, bằng tạo một áp suất nhẹ nhàng lên đầu cột sắc ký.
Bỏ 20 ml dịch rửa giải đầu tiên và lấy dịch còn lại. Thỉnh thoảng, kiểm tra cột dưới ánh sáng tử ngoại trong suốt quá trình sắc ký và dừng dòng chảy khi phía trên của dải huỳnh quang tương ứng với vitamin A là khoảng 5 mm từ đáy của cột. (Đèn UV có bức xạ yếu ở vùng 300 nm. cần sử dụng đèn có khẩu độ hoặc màn hình hẹp nhằm giảm lượng bức xạ tới mức tối thiểu để phát hiện vitamin A trên cột). Chuyển dịch rửa giải vào một bình bốc hơi thích hợp và bốc hơi dung môi ether dầu hỏa hoàn toàn trong chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C hoặc với một luồng khí nitrogen ở nhiệt độ phòng. Hòa tan cắn trong khoảng 10 ml ether dầu hỏa (TT)
– Sắc ký cột thứ hai: Chuyển dung dịch ether dầu hỏa thu được ở cột thứ nhất lên bề mặt cột thứ hai. Rửa bình bốc hơi với 10 ml ether dầu hỏa (TT) chia thành từng phần nhỏ, thêm từng phần dịch rửa vào cột thứ hai và để chảy qua cột, bỏ dịch rửa giải. Khi còn khoảng 1 ml ether dầu hỏa phía trên bề mặt cột, thêm 75 ml toluen (TT), rửa giải bằng hút chân không nhẹ nhàng (khoảng 125 mm thủy ngân), thu được dịch rửa giải. Bay hơi toluen trong chân không ở nhiệt độ không quá 40 °C hoặc với một dòng khí nitrogen ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch định lượng: Hòa tan cắn thu được ở phần sắc ký cột thứ hai trong một lượng nhỏ ethylen diclorid (TT) chuyển vào bình định mức dung tích 10 ml, pha loãng đến vạch với ethylen diclorid (TT) và lắc đều thu được dung dịch định lượng.
Tạo màu: Lấy ba ống tạo màu đường kính trong khoảng 20 mm, đánh số thứ tự 1, 2 và 3. Thêm vào mỗi ống 1 ml dung dịch thử.

Chính xác 45 s sau khi thêm thuốc thử tạo màu, đo độ hấp thụ của ba dung dịch (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 500 nm, dùng ethylen clorid (TT₁) làm mẫu trắng. Tương tự, 45 s sau lần đo thứ nhất, tiếp tục xác định độ hấp thụ của dung dịch 2 và 3 ở 550 nm trong cùng điều kiện. Ký hiệu các độ hấp thụ đo được là A¹₅₀₀, A²_500, A³_500^,  A²_550,  A³₅₅₀ trong đó số được viết lên trên là số của ống còn số viết phía dưới là bước sóng đo.
Tính kết quả:
Tính hàm lượng (μg) của vitamin D trong lượng chế phẩm bằng công thức:

(C_s/C)/(A_u/A_s)

Trong đó:
C_s là nồng của vitamin D trong dung dịch chuẩn (μg/ml).
C là nồng độ của mẫu thử (tính theo g, viên nén, viên nang…) trong mỗi ml của dung dịch định lượng.
Au là giá trị của (A²₅₀₀ – A³₅₀₀) – 0,67(A²₅₀₀ – A³₅₀₀) được xác định từ các độ hấp thụ đo được của dung dịch định lượng.
A_s là giá trị của (A¹₅₀₀ – A²₅₀₀) được xác định từ các độ hấp thụ đo được của dung dịch chuẩn.