XÁC ĐỊNH CÁC CHẤT BẢO QUẢN KHÁNG KHUẨN (Phụ lục 10.20) – Dược điển Việt Nam 5

Một thành phần quan trọng của các chế phẩm thuốc tiêm đa liều là các chất làm giảm thiểu nguy cơ xâm nhập của vi khuẩn cho phần còn lại sau khi đã dùng một phần chế phẩm. Các chất này thuộc nhóm chất bảo quản kháng khuẩn. Tên và hàm lượng các chất bảo quản phải ghi trên nhãn thuốc. Các phương pháp phân tích sau đây áp dụng cho một số chất bảo quản thông dụng nhất, nhằm kiểm tra sự có mặt của chất bảo quản với hàm lượng không được vượt quá 20 % lượng ghi trên nhãn.
Nồng độ chất bảo quản kháng khuẩn được thêm vào một thuốc tiêm đa liều hay đơn liều, một chế phẩm thuốc nhỏ tai nhỏ mũi hay nhỏ mắt có thể bị giảm đi trong thời hạn dùng của sản phẩm. Vì thế, nhà sản xuất cần xác định mức liều thấp nhất còn tác dụng, và công thức sản xuất phải được nghiên cứu sao cho mức liều này vẫn giữ được cao hơn mức tối thiểu trong suốt thời hạn sử dụng. Tại thời điểm sản xuất, sản phẩm cần chứa một lượng chất bảo quản kháng khuẩn được công bố (trong phạm vi ± 20 % dao động cho phép trong sản xuất và kiểm nghiệm). Việc công bố về lượng trên nhãn của chất bảo quản kháng khuẩn không có nghĩa là lượng này được giữ nguyên trong thời hạn sử dụng, mà chỉ là sự khẳng định về hàm lượng được thêm vào nằm trong giới hạn của quy trình sản xuất và không vượt quá 20 %. Cách chỉ hàm lượng chất bảo quản sẽ là một trị số tiếp theo là đơn vị đo, ví dụ 0,015 mg/ml hay 0,1 %.
Các chất kháng khuẩn thông dụng nhất là 2 hợp chất cơ kim thủy ngân (phenylmercuric nitrat và thimerosal), 4 ester đồng đẳng của acid p-hydroxybenzoic, phenol, benzyl alcol và clorobutanol. Phương pháp xác định 2 hợp chất cơ kim thủy ngân là phương pháp cực phổ các chất còn lại có thể xác định bằng phương pháp sắc ký khí.
Ngoài ra, phương pháp thông dụng hiện nay để xác định các paraben là phương pháp sắc ký lỏng.

Phương pháp sắc ký khí

Quy trình chung ghi dưới đây có thể áp dụng để định lượng benzyl alcol, clorobutanol, phenol và các paraben (methyl, ethyl, propyl và butyl ester của acid p-hydroxybenzoic).
Đối với các paraben nếu có mặt thì có thể xác định riêng từng chất một. Chuẩn bị dung dịch chuẩn nội và dung dịch chuẩn cho mỗi chất như chỉ dẫn dưới đây. Trừ khi có chỉ dẫn khác, chuẩn bị dung dịch thử từ những lượng đo chính xác dung dịch chuẩn nội và mẫu thử sao cho nồng độ của chất bảo quản cần phân tích và thành phần dung môi gần với nồng độ và thành phần dung môi của dung dịch chuẩn.
Các thông số của máy sắc ký khí được khuyến cáo trong Bảng 10.20.1 kèm theo, khí mang có thể là khí heli hoặc nitrogen, detector ion hóa ngọn lửa.

Benzyl alcol

Dung dịch chuẩn nội: Hòa tan khoảng 380 mg phenol (TT) trong 10 ml methanol (TT) trong một bình định mức 200 ml. Thêm nước đến vạch, lắc đều.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan khoảng 180 mg chất chuẩn benzyl alcol được cân chính xác, trong 20,0 ml methanol (TT) chứa trong một bình định mức 100 ml. Thêm dung dịch chuẩn nội đến vạch, lắc đều.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt các thể tích bằng nhau (khoảng 5 μl) của dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại các sắc đồ với thiết bị sắc ký đã được điều chỉnh theo các thông số ghi trong Bảng 10.20.1.
Từ tỷ số diện tích pic benzyl alcol và diện tích pic phenol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nồng độ chất đối chiếu benzyl alcol trong dung dịch chuẩn, tính hàm lượng benzyl alcol (C₇H₈O) trong chế phẩm.

Clorobutanol

Dung dịch chuẩn nội: Hòa tan khoảng 140 mg benzaldehyd (TT) trong một bình định mức 100 ml. Thêm 10 ml methanol (TT), lắc nhẹ để hòa tan rồi thêm nước cho đến vạch, lắc đều.
Dung dịch chuẩn: Chuyển khoảng 125 mg chất chuẩn clorobutanol được cân chính xác vào một bình định mức 25 ml. Thêm 2 ml methanol (TT), lắc nhẹ để hòa tan rồi pha loãng với nước đến vạch, lắc đều. Lấy 5,0 ml dung dịch thu được và 5,0 ml dung dịch chuẩn nội cho vào một bình định mức 25 ml, lắc đều để thu được dung dịch có nồng độ clorobutanol khoảng 2,5 mg/ml.

Bảng 10.20.1 – Các thông số của máy sắc ký

Ghi chú:
G16: Polyethylen glycol có phân tử lượng khoảng 15000
G2: Nhựa dimethylpolysiloxan.
S1A: Đất silic loại dùng cho sắc ký khí được nung bằng cách trộn dialomid vơi Natri carbonat và nung ở nhiệt độ trên 900 ^oC
Dung dịch thử: Pha loãng (nếu cần) một thể tích chính xác chế phẩm thử với methanol (TT) để thu được dung dịch chứa không quá khoảng 5,0 mg clorobutanol trong 1 ml. Trộn 3,0 ml dung dịch thu được với 3,0 ml dung dịch chuẩn nội, lắc đều.
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống:
Tiêm 1 μl dung dịch chuẩn. Tiến hành sắc ký theo các điều kiện ghi trong Bảng 10.20.1, Đặt nhiệt độ buồng tiêm ở 180 °C và nhiệt độ của detector ở 220 °C. Ghi sắc ký đồ.
Thời gian lưu tương đối của pic benzaldehyd là 0,8 và của pic clorobutanol là 1,0; độ phân giải giữa pic benzaldehyd và pic clorobutanol không được nhỏ hơn 2,0; độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic của các lần tiêm lặp lại phải không được lớn hơn 2,0 %.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt các thể tích bằng nhau (khoảng 1μl) dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào máy sắc ký. Từ tỷ số diện tích pic clorobutanol và diện tích pic benzaldehyd thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nồng độ chất đối chiếu clorobutanol trong dung dịch chuẩn, tính hàm lượng clorobutanol trong chế phẩm.

Phenol

Dung dịch chuẩn nội: Hút 1,0 ml benzyl alcol chuẩn cho vào một bình định mức 500 ml, thêm methanol (TT) đến vạch, lắc đều.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan khoảng 75 mg chất chuẩn phenol được cân chính xác, trong 7,5 ml methanol (TT) chứa trong một bình định mức 100 ml. Thêm 20,0 ml dung dịch chuẩn nội rồi thêm nước đến vạch, lắc đều.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt các thể tích bằng nhau (khoảng 3 μl) dung dịch chuẩn và dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại các sắc đồ trên hệ thống sắc ký đã được điều chỉnh các thông số theo Bảng 10.20.1. Từ tỷ số diện tích pic phenol và diện tích pic benzyl alcol thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nồng độ chất đối chiếu phenol trong dung dịch chuẩn, tính hàm lượng phenol trong chế phẩm.

Methylparaben và propylparaben

Dung dịch chuẩn nội: Cho khoảng 200 mg benzophenon (TT) vào một bình định mức 250 ml, pha loãng bằng diethylether (TT) đến vạch, lắc đều.

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 100 mg methyl-paraben chuẩn và 10 mg propylparaben chuẩn vào một bình định mức 200 ml. Pha loãng bằng dung dịch chuẩn nội đến vạch, lắc đều. Hút 10,0 ml dung dịch thu được cho vào một bình nón cỡ 25 ml rồi tiến hành như chỉ dẫn ở mục Dung dịch thử bắt đầu từ ‘Thêm 3 ml pyridin (TT)…”.
Dung dịch thử: Hút 10,0 ml mẫu thử và 10,0 ml dung dịch chuẩn nội cho vào một bình gạn nhỏ. Lắc mạnh, để cho phân lớp, rút lớp nước vào một hình gạn khác và chuyển lớp ether vào một hình thủy tinh nhỏ qua một phễu lọc có natri Sulfat khan (TT). Chiết lớp nước 2 lần, mỗi lần với 10 ml diethylether (TT) và lọc dịch chiết qua phễu có natri sulfat khan (TT).
Làm bay hơi dịch chiết ether dưới một luồng không khí không đèn khi còn khoảng 10 ml thì chuyển sang một bình nón 25 ml. Thêm 3 ml pyridin (TT) rồi làm bay hơi ether hoàn toàn và đun sôi trên bếp nóng cho đến khi còn khoảng 1 ml. Làm nguội, thêm 1 ml thuốc thử silan hóa thích hợp như his(trimethylsilyl)- trifluoroaectamid, bis(trimethylsilyl) acetamid, hoặc hỗn hợp của hexamethyldisilazan và trimethylclorosilan (tỷ lệ 2:1 hoặc 3:1 theo thể tích). Trộn đều rồi để yên ít nhất 15 min.
Cách tiến hành: Tiêm riêng biệt các thể tích bằng nhau (2 μl) dung dịch đã được silan hóa của dung dịch chuẩn và của dung dịch thử vào hệ thống sắc ký, ghi lại các sắc đồ trên hệ thống thiết bị đã được điều chỉnh theo các thông số ghi trong Bảng 10.20.1.
Từ tỷ số diện tích pic methylparaben và diện tích pic benzophenon thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nồng độ chất đối chiếu methylparaben trong dung dịch chuẩn, tính hàm lượng methylparaben trong chế phẩm.
Cũng theo cách tương tự, từ tỷ số diện tích pic propyl paraben và diện tích pic benzophenon thu được trên sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn, nồng độ chất đối chiếu propylparaben trong dung dịch chuẩn, tính hàm lượng của propylparaben trong chế phẩm. Ethylparaben và butylparaben cũng có thể được định lượng bằng cách tương tự như trên.

Phương pháp sắc ký khí sử dụng cột mao quản

Ngoài phương pháp sắc ký khí sử dụng cột nhồi như trên, các chất benzyl alcol, clorobutanol, phenol có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký khí sử dụng cột mao quản với các điều kiện sắc ký như sau; Cột DB1 (30 m X 0,25 mm X 0,25 μm), pha tĩnh 100 % dimethylpolysiloxan, tốc độ dòng 1,2 ml/min, nhiệt độ cột là 320 °C.

Phương pháp sắc ký lỏng xác định methylparaben và propylparaben

Pha động: Nước – acetonitril (50 : 50), điều chỉnh tỷ lệ nếu cần.
Dung dịch thử: Pha loãng chính xác một thể tích dung dịch chế phẩm có chứa khoảng 0,5 mg methylparaben hoặc 0,2 mg propylparaben tới vừa đủ 20,0 ml bằng pha động. Lắc đều, lọc.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác một lượng methylparaben chuẩn và propylparaben chuẩn, hoà tan trong pha động để thu được dung dịch có nồng độ methylparaben khoảng 0,025 mg/ml và nồng độ propylparaben khoảng 0,010 mg/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (15 cm X 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm).
Detector quang phổ hấp thụ từ ngoại đặt ở bước sóng 256 nm.
Thể tích tiêm: 20 μl.
Tốc độ dòng: 1 ml/min.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký; Tiến hành sắc ký đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ, thứ tự rửa giải lần lượt là methylparaben và propỵlparaben. Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic methylparaben và propylparaben trong 6 lần tiêm lặp lại không được lớn hơn 2,0 %; hệ số đối xứng của các pic nhỏ hơn 2; hệ số phân giải giữa các pic lớn hơn 2,5.
Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Tính hàm lượng của methylparaben, C₈H₈O₃ và propylparaben, C₁₀H₁₂O₃ trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử, hàm lượng C₈H₈O₃ và C₁₀H₁₂O₃ trong methylparaben và propylparaben chuẩn.

Phương pháp cực phổ

Phenylmercuric nitrat

Dung dịch thử: Hút 10,0 ml mẫu thử cho vào một bình định mức 25 ml, thêm 2 ml dung dịch kali nitrat 1 % (TT) và 10 ml dung dịch đệm borat kiềm pH 9,2 (TT), điều chỉnh đến pH 9,2 nếu cần bằng cách thêm acid nitric 2 M (TT).
Thêm 1,5 ml dung dịch gelatin 0,1 % (TT) mới pha, thêm dung dịch đệm borat kiềm pH 9,2 (TT) đến vạch, trộn đều.
Dung dịch chuẩn: Hòa tan khoảng 100 mg phenylmercuric nitrat chuẩn được cân chính xác trong dung dịch natri hydroxyd 0,4 % (TT) chứa trong một bình định mức 1000 ml, làm ấm nếu cần để dễ hòa tan. Thêm dung dịch natri hydroxyd 0,4 % (TT) đến vạch, lắc đều. Hút 10,0 ml dung dịch thu được cho vào một bình định mức 25 ml rồi tiến hành như chỉ dẫn ở mục Dung dịch thử bắt đầu từ “Thêm 2 ml dung dịch kali nitrat …
Cách tiến hành: Hút một phần dung dịch thử cho vào bình cực phổ, đuổi không khí trong dung dịch bằng dòng khí nitrogen thổi qua trong 15 min. Đặt điện cực giọt thủy ngân của máy cực phổ thích hợp và ghi lại cực phổ đồ trong khoảng điện thế từ -0,6 V đến -1,5 V so với điện cực calomel bão hòa. Xác định cường độ dòng khuếch tán của dung dịch thử, (i_d)_u là hiệu số giữa cường độ dòng ion dư và cường độ dòng giới hạn. Theo cách tương lự, xác định đồng thời cường độ dòng khuếch tán, (i_d)_s, của dung dịch chuẩn. Tính hàm lượng của phenylmercuric nitrat (C₆H₅HgNO₃) trong mẫu thử tính bằng μg/ml theo công thức sau:

2,5 x C x (i_d)_u /(i_d)_s

Trong đó: C là nồng độ (μg/ml) của phenylmercuric nitrat trong dung dịch chuẩn

Thimerosal

Dung dịch chuẩn: Vào ngày sử dụng, cân chính xác khoảng 25 mg thimerosal chuẩn, chuyển vào bình định mức 250 ml, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Tiến hành trong điều kiện tránh ánh sáng. Hút 15,0 ml dung dịch thu được cho vào một bình định mức 25 ml, thêm 1,5 ml dung dịch gelatin 0.1 % (TT) rồi thêm dung dịch kali nitrat (TT) đến vạch, lắc đều.

Dung dịch thử: Hút 15,0 ml mẫu thử cho vào một bình định mức 25 ml, thêm 1,5 ml dung dịch gelatin 0,1 % (TT) rồi thêm dung dịch kali nitrat 1% (TT) đến vạch, lắc đều.
Cách tiến hành: Hút một phần dung dịch thử cho vào bình cực phổ, đuổi không khí bằng cách sục dòng khí nitrogen qua dung dịch đó trong 15 min. Đặt điện cực giọt thủy ngân của máy cực phổ thích hợp và ghi lại cực phổ đồ trong khoảng điện thế từ -0,2 V đến -1,4 V so sánh với điện cực calomel bão hòa. Xác định cường độ dòng khuếch tán của dung dịch thử, (i_d)_u là hiệu số giữa cường độ dòng tồn dư và cường độ dòng giới hạn. Theo cách tương tự, xác định đồng thời cường độ dòng khuếch tán, (i_d)_s, của dung dịch chuẩn. Tính hàm lượng (μg/ml) của thimerosal (C₆H₉HgNaO₂S) trong mẫu thử theo công thức sau:

1,667 x C x (i_d)_u / (i_d)_s

Trong đó: C là nồng độ (μg/ml) của thimerosal trong dung dịch chuẩn