Xác định hàm lượng Aflatoxin B1 trong dược liệu (Phụ lục 12.21) – Dược điển Việt Nam 5

Lưu ý : Các aflatoxin là những chất rất độc và gây ung thư. Cần thực hiện các thao tác trong tủ hút hơi độc bất cứ khi nào có thể. Phải đặc biệt lưu ý khi các độc tố này ở dạng bột khô vì chúng có tính chất hút tĩnh điện và khuynh hướng phát tán vào môi trường làm việc; trong trường hợp này nếu có thể thì thao tác trong hộp kín có găng tay. Cần tuân thủ Quy trình khử nhiễm aflatoxin cho các chất thải phòng thí nghiệm đã được Cơ quan nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) xây dựng.

Các aflatoxin là những độc tố vi nấm xuất hiện trong tự nhiên, chủ yếu do nấm mốc Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus tạo ra. Các loài nấm này khá phổ biến và phát tán trong tự nhiên, rất hay được tìm thấy khi một số loại hạt này mầm và mọc ở những điều kiện khắc nghiệt như hạn hán. Nấm mốc xuất hiện trong đất, trong thực vật đang phân hủy, trong cỏ khô và ở những hạt đang bị vi khuẩn phá hủy, sẽ tác động vào tất cả các loại cơ chất hữu cơ bất cứ khi nào hoặc ở đâu có điều kiện thuận lợi cho chúng phát triển. Những điều kiện thuận lợi đó là hàm lượng ẩm cao và nhiệt độ cao. Ít nhất đã có 13 loại aflatoxin khác nhau được tạo ra trong thiên nhiên và phần lớn trong số đó được biết là có độc tính cao và gây ung thư.

Aflatoxin B₁ được xác định là chất độc nhất. Các dược liệu bị nhiễm aflatoxin phải được xác định bằng một phương pháp phân tích đã được thẩm định. Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, các dược liệu chỉ được nhiễm aflatoxin B₁ không quá 2 μg/kg. Cơ quan quản lý dược cũng có thể yêu cầu một giới hạn cho phép là 4 μg/kg cho tổng lượng các aflatoxin B₁, B₂, G₁ và G₂.

Phương pháp mô tả dưới đây được nêu ra như một ví dụ, đã được chứng minh là thích hợp cho việc xác định aflatoxin trong gừng, trong quả phan tả diệp v.v… Khi áp dụng phương pháp này cho các dược liệu khác, cần phải xác định tính thích hợp của nó; nếu không, phải dùng một phương pháp được thẩm định khác.

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3).

Các aflatoxin đều bị ánh sáng phân hủy. Cần tiến hành định lượng trong khu vực tránh ánh sáng ban ngày bằng cách dùng lá chắn tia tử ngoại trên cửa sổ kết hợp với ánh sáng dịu, hoặc dùng rèm che kết hợp với chiếu sáng nhân tạo (cụ thể bằng đèn tuýp huỳnh quang). Bảo quản các dung dịch chứa aflatoxin tránh ánh sáng ban ngày.

Tráng rửa dụng cụ thủy tinh trước khi dùng bằng dung dịch acid sulfuric 10 % (theo thể tích) (TT), sau đó rửa cẩn thận bằng nước cất cho đến khi không còn vết acid.

Dung dịch thử:

Dùng cột sắc ký ái lực miễn dịch chứa kháng thể đối với aflatoxin B1 có dung lượng không ít hơn 100 μg aflatoxin B₁ và khả năng thu hồi không thấp hơn 80 % khi cho một dung dịch 5 μg aflatoxin B₁ trong hỗn hợp 12,5 ml methanol (TT) và 87,5 ml nước chảy qua.

Giữ cột sắc ký ái lực miễn dịch ở nhiệt độ phòng. Lấy 5.00 g dược liệu đã tán bột (qua rây số 500), thêm 100.0 ml hỗn hợp 30 thể tích nước và 70 thể tích methanol (TT); chiết bằng siêu âm trong 30 min. Lọc dịch chiết qua giấy lọc. Hút 10,0 ml dịch lọc trong cho vào một bình nón cỡ 150 ml. Thêm 70,0 ml nước, lắc đều. Hút 40,0 ml dung dịch cho chảy qua cột sắc ký ái lực miễn dịch với tốc độ 3 ml/min (không vượt quá 5 ml/min). Rửa cột bằng nước 2 lần, mỗi lần 10 ml với tốc độ không quá 5 ml/min rồi làm khô bằng cách áp một chân không nhẹ trong 5 đến 10 s, hoặc bằng cách dùng bơm tiêm thổi không khí qua cột sắc ký trong 10 s.

Cho 0,5 ml methanol (TT) lên cột và để chảy qua cột nhờ trọng lực. Thu dịch rửa giải vào một bình định mức cỡ 5 ml. Sau 1 min, lại cho tiếp 0,5 ml methanol (TT) và hứng lấy dịch rửa giải lần 2. Chờ 1 min sau lại thực hiện lần rửa giải thứ 3 nữa cũng với 0,5 ml methanol (TT). Thu tối đa dịch rửa giải bằng cách nén không khí hoặc tạo một chân không nhẹ qua cột. Thêm nước vào bình định mức cho đủ 5 ml, lắc đều. Nếu thu được dung dịch trong thì có thể dùng ngay để phân tích. Nếu dung dịch không trong suốt thì cần lọc trước khi tiêm sắc ký. Dùng màng lọc sẵn dùng 1 lần (màng lọc polytetrafiuoroethylen cỡ lỗ lọc 0,45 μm) đã được chứng minh là không gây mất aflatoxin do lưu giữ.

Xem thêm: Xác định tạp chất lẫn trong dược liệu (Phụ lục 12.11) – Dược điển Việt Nam 5

Dung dịch chuẩn gốc 1 aflatoxin B₁:

Hòa tan aflatoxin B₁ (TT) trong hỗn hợp acetonitril – toluen (2 : 98) để có dung dịch chứa 10 μg/ml. Xác định nồng độ chính xác aflatoxin B₁ trong dung dịch này bằng cách đo độ hấp thụ (Phụ. lục 4.1) trong khoảng bước sóng giữa 330 nm và 370 nm trong cóng đo thạch anh.

Tính nồng độ aflatoxin B₁, biểu thị bằng μg/ml, bằng công thức sau:

(A x M x 100)/(ε x l)

Trong đó:

A là độ hấp thụ đo được tại cực đại hấp thụ trong khoảng bước sóng 330nm đến 370 nm;

M là khối lượng phân tử của aflatoxin B₁ (312 g/mol);

ε là hệ sổ hấp thụ phân từ gam của aflatoxin B₁ trong hỗn hợp dung môi toluen – acetonitril (1930 m² /mol);
l là bề dày quang học của ống đo (1 cm).

Dung dịch chuẩn gốc 2 aflatoxin B₁:

Chuẩn bị một dung dịch chuẩn gốc 2 chứa 100 μg aflatoxin B₁ trong 1 ml bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc 1 aflatoxin B₁ với hỗn hợp acetonitril – toluen (2 : 98). Bọc kín bình chứa trong giấy nhôm và bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 °C. Trước khi dùng, chỉ bỏ giấy bọc nhôm khi dung dịch chứa trong bình đạt tới nhiệt độ phòng. Nếu cần bảo quản dung dịch trong một thời gian dài (khoảng 1 tháng), cần cân xác định khối lượng bình chứa trước và sau mỗi lần sử dụng.

Các dung dịch chuẩn aflatoxin B₁

Lấy các thể tích dung dịch chuẩn gốc 2 aflatoxin B₁ như chỉ dẫn trong Bảng 12.21.1 cho vào mỗi bình định mức 250 ml. Thổi vào bình một luồng khí nitrogen ở nhiệt độ phòng cho đến khi vừa bay hết hơi dung môi. Thêm vào mỗi bình 75 ml methanol (TT), để cho aflatoxin hòa tan rồi pha loãng với nước đủ 250 ml.

Bảng 12.21.1 – Các dung dịch chuẩn aflatoxin B₁

Thiết lập đường chuẩn

Dùng các dung dịch chuẩn aflatoxin B₁ từ số 1 đến số 5 để xây dựng đường chuẩn; đường này sẽ bao phủ một khoảng tương ứng từ 1 μg đến 8 μg aflatoxin B₁ trong 1 kg dược liệu. Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn. Nếu hàm lượng aflatoxin B₁ trong mẫu cần kiểm tra nằm ngoài khoảng tuyến tính, dung dịch thử cần phải được pha loãng đến khi hàm lượng aflatoxin thích hợp với đường chuẩn đã thiết lập.

Điều kiện sắc ký

Cột kích thước (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm).

Pha động A (dùng khi dẫn xuất hóa sau cột với phản ứng quang hóa hoặc với pyridinium broinid): acetonitril – methanol – nước (2 :3 :6 ); Pha động B (dùng khi dẫn xuất hóa sau cột bằng brom do quá trình điện hóa tạo ra); Thêm 0.12 g kali bromid (TT) và 350 μl dung dịch acid nitric loãng (TT) vào 1 L pha động A.

Tốc độ dòng: 1 ml/min.

Detector huỳnh quang với kính lọc ánh sáng kích thích 360 nm và kính lọc tia phát xạ 420 nm, hoặc thiết bị khác tương đương. Đối với detector điều chỉnh được, chế độ cài đặt được khuyến cáo là bước sóng kích thích 366 nm và bước sóng phát xạ 435 nm.

Thể tích tiêm: 500 μl.

Dẫn xuất hóa sau cột bằng pyridinium hydrobromid perbromid (PBPB)

– Bơm không có xung;

– Bộ trộn chữ T có thể tích chết bằng 0;

– Ống phản ứng bằng polytetrafluoroethylen, l = 0,45 m;

– Φ= 5 mm;

– Pha động A;

– Thuốc thử dẫn xuất hóa sau cột: Hòa tan 50 mg pyridinium hydrobromid perbromid (TT) trong 1000 ml nước (bảo quản tránh ánh sáng và dùng trong 4 ngày);

– Tốc độ dòng thuốc thử tạo dẫn xuất: 0,4 ml/min.

Xem thêm: Xác định hàm lượng nước bằng phương pháp cất với dung môi (Phụ lục 12.13) – Dược điển Việt Nam 5

Dẫn xuất hóa sau cột với phản ứng quang hóa (PHRED)

– Ống phản ứng với đèn UV hơi thủy ngân áp suất thấp 254 nm (tối thiểu 8 W);

– Gương hỗ trợ;

– Cuộn phản ứng: Ống polytetrafluoroethylen bao chặt quanh bóng UV, 1 = 25 m; Φ = 0,25 mm; thể tích trống danh định 1,25 ml;

– Thời gian chiếu: 2 min;

– Pha động A.

Dẫn xuất hóa sau cột bằng brom mới sinh từ phản ứng điện hóa (KOBRA)

– Pin KOBRA: Pin điện hóa sinh ra brom hoạt tính để tạo dẫn xuất với aflatoxin, làm tăng sự phát huỳnh quang; sẵn có trên thị trường; nguồn điện 1 chiều cùng bộ với pin KOBRA, cung cấp một dòng không đổi khoảng 100 pA;

– Ống phản ứng bằng polytetrafluorocthylen, 1 = 0,12 m; Φ = 0,25 mm;

– Pha động B.

Thứ tự rửa giải

Aflatoxin G₂, aflatoxin G₁, aflatoxin B₂, aflatoxin B₁.

Tính kết quả

Thiết lập phương trình đường chuẩn y= ax + b với nồng độ aflatoxin B₁ (μg/ml) trên trục X và tín hiệu đáp ứng (S) trên trục y. Nồng độ aflatoxin B₁ (C) trong dung dịch đo được tính bằng biểu thức:

(S – b) / a

Tính hàm lượng aflatoxin B₁ trong dược liệu, biểu thị bằng ng/g, theo công thức sau:

(V₁ x V₂ x C)/(m x V₁)

Trong đó:

m là khối lượng dược liệu lẩy để phân tích (g).

V₁ là thể tích dung môi được dùng để chiết (ml).

V₁ là thể tích dịch chiết được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch (ml).

V₂ là thể tích dung dịch cuối cùng sau khi rửa giải từ cột sắc ký ái lực miễn dịch và pha loãng (ml).

C là nồng độ aflatoxin đo được từ dung dịch thử (ng/ml).

Sự có mặt aflatoxin B₁ có thể được khẳng định bằng cách ghi lại sắc ký đồ dung dịch thử không qua dẫn xuất hóa sau cột; tín hiệu đáp ứng của aflatoxin B₁ trên sắc đồ này bị giảm đi đáng kể (hơn 10 lần).