Xác định hàm lượng nitơ protein của vắc xin và sinh phẩm bằng thuốc thử Nessler (Phụ lục 15.32) – Dược Điển Việt Nam 5

Nguyên lý

Phương pháp dựa vào tính chất của thuốc thử Nessler cho phản ứng màu với ion amoni (NH₄⁺) được tạo thành sau khi vô cơ hóa các protein.

=> Đọc thêm: Xác định hàm lượng thimerosal trong vắc xin và sinh phẩm (Phụ lục 15.29) – Dược Điển Việt Nam 5.

Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử

Cho 1 ml chế phẩm và 1 ml dung dịch acid tricloroacetic 20 % (TT) vào một ống ly tâm 10 ml, để ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C trong 10 h đến 12 h. Sau đó ly tâm 3500 r/min trong 1 h, loại bỏ phần nước. Rửa tủa bằng 2 ml dung dịch acid tricloroacetic 5 %, tiếp tục ly tâm 3500 r/min trong 1 h, loại bỏ phần nước. Thêm vào cắn 0,2 ml acid sulfuric (TT) đem vô cơ hóa trên bếp cát cho đến khi dung dịch mất màu. Để tăng tốc độ phản ứng thỉnh thoảng cho vài giọt dung dịch oxy già đậm đặc vào ống đốt sau khi làm nguội. Khi chế phẩm đã được vô cơ hóa hoàn toàn, dung dịch mất màu, thêm nước cất 2 lần vừa đủ b ml, thu được dung dịch A.

Lấy 1 ml dung dịch A vào ống nghiệm, thêm 8,5 ml nước cất 2 lần và 0,5 ml thuốc thử Nessler (TT), được mẫu thử.

Chuẩn bị mẫu trắng: Trộn đều 9,5 ml nước cất 2 lần và 0,5 ml thuốc thử Nessler (TT).

Dựng đường chuẩn

Hút dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng 0,05 mg nitơ/ml vào các ống nghiệm theo thứ tự sau: 0,1 ml; 0,2 ml; 0,3 ml; 0,4 ml; 0,5 ml; 0,6 ml; 0,7 ml. Thêm nước cất 2 lần vừa đủ 9,5 ml và 0,5 ml thuốc thử Nessler (TT).

Lắc đều các ống nghiệm.

Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 420 nm.

Vẽ đồ thị đường chuẩn.

Lượng nitơ protein trong chế phẩm được tính theo công thức sau:

X = (a x b x 6,25)/(1,0 x 1,0)

Trong đó:

a là lượng nitơ tìm được trên đường chuẩn (mg);

b là thể tích dung dịch A (ml);

1,0 là thể tích mẫu sau pha loãng đem so màu (ml);

1,0 là thể tích mẫu đem tủa rồi vô cơ hóa (ml);

6,25 là hệ số chuyển đổi protein từ nitơ.

Cách pha dung dịch amoni sulfat chuẩn có hàm lượng nitơ 0,05 mg/ml: Cân 0,2375 g amoni sulfat (đã được sấy khô trong bình hút ẩm bằng silica gel đến khối lượng không đổi), hòa tan vừa đủ 500 ml bằng nước cất 2 lần. Dung dịch vừa pha có hàm lượng nitơ 0,1 mg/ml, trước khi dùng pha loãng gấp đôi bằng nước cất 2 lần.

=> Đọc thêm: Xác định hiệu lực vắc xin dại theo phương pháp NIH (Phụ lục 15.31) – Dược Điển Việt Nam 5.

Tiêu chuẩn cho phép

Hàm lượng nitơ protein trong vắc xin và sinh phẩm theo qui định riêng.