Xác định BSA tồn dư trong Vắc xin (Phụ lục 15.45) – Dược điển Việt Nam 5
Nếu nội dung bài viết chưa chính xác, vui lòng thông báo cho chúng tôi tại đây
Th7
BSA (Bovine Serum Albumin) là một loại protein dưới dạng huyết thanh bào thai bò (FBS – Fetal Bovine Serum) hoặc huyết thanh bào thai bò (FSC – Fetal Calf Serum) được bổ sung trong quá trình nuôi cấy tế bào để sản xuất vắc xin. Theo Khuyến cáo của WHO, tất cả các dạng protein có nguồn gốc từ động vật nếu sử dụng trong sản xuất vắc xin đều phải được kiểm soát để hạn chế các phản ứng phụ.
Có thể sử dụng phương pháp điện di miễn dịch đối lưu hoặc các kit thương phẩm (hoặc tự gắn) để xác định BSA tồn dư trong vắc xin.
PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MIỄN DỊCH ĐỐI LƯU
Nguyên lý
Điện di miễn dịch đối lưu là kỹ thuật dựa trên sự ngưng kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể xảy ra khi cho kháng nguyên và kháng thể ở nồng độ đủ để xảy ra phản ứng ngưng kết di chuyển trên gel agarose. Nếu kháng thể và kháng nguyên ngưng kết đặc hiệu sẽ cho cùng kết tủa và ngược lại, sẽ không có cùng kết tủa nếu kháng nguyên và kháng thể không ngưng kết đặc hiệu. Trong kỹ thuật này, dưới tác dụng của cường độ điện trường, kháng nguyên và kháng thể gặp nhau và kết hợp đặc hiệu với nhau nhanh hơn trên gel agarose.
Thiết bị, dụng cụ
Buồng điện di nằm ngang.
Tấm thủy tinh (85 x 85) mm.
Bàn cân bằng với dụng cụ đo giọt nước.
Ampe kế.
Đục giếng thạch đường kính 3 mm.
Khay giữ ẩm.
Khay thủy tinh dùng để nhuộm và rửa tiêu bản.
Giấy Whatman No.1 và No.3.
Vải gạc lọc Agarose.
Xem thêm: Một số phương pháp miễn dịch sử dụng trong kiểm định Vắc xin (Phụ lục 15.44) – Dược điển Việt Nam 5
Hóa chất, dung dịch thử
Agarose.
Dung dịch đệm barbital 0,1 M pH 8,6.
Dung dịch natri clorid 0,85 % hoặc đệm PBS pH 7,2.
Dung dịch nhuộm màu Amido Black 10B 0,1 % hoặc dung dịch thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue R250.
Dung dịch tẩy màu: Dung dịch acid acetic 2 % hoặc hỗn hợp ethanol/acid acetic (gồm 100 ml ethanol, 70 ml acid acetic và nước cất vừa đủ 1000 ml).
Huyết thanh thỏ kháng BSA (Anti-Bovine Albumin antibody produced in rabbit) đặc hiệu. Chứng dương (BSA) gồm 3 nồng độ: 0,005 %; 0,0005 % và 0,0001 %.
Cách tiến hành
Chuẩn bị tiêu bản
Hòa tan 1,5 g agarose trong 100 ml dung dịch đệm barbital 0,1 M, pH 8,6. Đun sôi nhẹ cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Lọc dung dịch trên bằng miếng vải gạc, tính lượng dùng vừa đủ, dùng pipet đổ thạch lên tấm thủy tinh (85 x 85) mm với thể tích khoảng (12-14) ml/1 tấm kính.
Để 30 min cho agarose đông cứng.
Dùng dụng cụ đục thạch thành 2 dãy và số lượng giếng tùy theo mẫu kiểm tra. Khoảng cách giữa các giếng khoảng 10 mm.
Cho mẫu vào tiêu bản
Hút 16 μl đến 18 μl mẫu vắc xin cần kiểm tra cho vào dãy lỗ cột thứ nhất.
Dây lỗ cột thứ 2 đối diện cho huyết thanh thỏ kháng BSA với lượng tương đương.
Chứng dương cho tương tự.
Chạy điện di
Đặt tiêu bản đã có vắc xin cần kiểm tra và huyết thanh thỏ kháng BSA trên vào buồng điện di nằm ngang có chứa dung dịch chạy điện di (dung dịch đệm barbital 0,1 M pH 8,6). Dãy có vắc xin nằm về phía cực dương, dãy có huyết thanh thỏ kháng BSA nằm về phía cực âm.
Dùng 2 miếng giấy Whatman thấm nối tiếp giữa bề mặt tiêu bản với dung dịch chạy điện di ở 2 cạnh bên của tiêu bản.
Cho dòng điện chạy vào với dòng điện có hiệu điện thế là 125 V (có thể 140 hoặc 170 V) và cường độ không vượt quá 90 mA. Thời gian chạy từ 30 – 60 min.
Rửa và nhuộm tiêu bản
Sau khi kết thúc chạy điện di, tiêu bản được lấy ra và ngâm trong dung dịch PBS pH 7,2 hoặc dung dịch natri clorid 0,85 % từ 16 h đến 24 h. Trong giai đoạn này, nên thay dung dịch 3 lần.
Rửa tiêu bản lại bằng nước cất và ngâm tiêu bản trong nước cất khoảng 30 min.
Đặt tiêu bản vào khay giữ ẩm.
Làm khô tiêu bản: Làm khô tự nhiên hoặc có thể bằng thổi hơi.
Rửa lại tiêu bản bằng nước cất và đặt tiêu bản vào khay có chứa dung dịch nhuộm Amido Black từ 5 đến 10 min.
Đổ thuốc nhuộm đi và tẩy màu tiêu bản bằng dung dịch acid acetic 2 %. Cứ như vậy, nhuộm và tẩy màu 3 lần.
Nếu dùng thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue thì cũng nhuộm và tẩy màu tương tự nhưng dùng dung dịch tẩy màu là hỗn hợp ethanol/acid acetic.
Để tiêu bản khô tự nhiên.
Đọc kết quả
Trên tiêu bản, giữa hai dãy giếng cột 1 và 2 sẽ xuất hiện đường tủa màu xanh. Đường tủa to và đậm tỷ lệ thuận với lượng BSA có trong mẫu thử.
Giếng mẫu vắc xin phải không tạo đường tủa với huyết thanh thỏ kháng BSA đặc hiệu hoặc đường tủa rất nhạt, nhỏ hơn đường tủa chuẩn có nồng độ 0,0001 % bovirte albumin. Điều này được cho là lượng BSA trong vắc xin thấp hơn 50 mg trong 1 liều vắc xin.
Giếng chứng dương có nồng độ có đường tủa từ đậm đến rất nhạt (vết) theo nồng độ tương ứng 0,005 %; 0,0005 % và 0,0001 % BSA.
PHƯƠNG PHÁP DÙNG KIT THƯƠNG PHẨM
Yêu cầu thử nghiệm: Phải tuân thủ đầy đủ các bước cơ bản của quy trình thực hiện theo hướng dẫn sử dụng, đánh giá thử nghiệm của từng bộ kit.
Mẫu kiểm tra cần được lặp lại ít nhất 2 giếng/độ pha.
Tính kết quả: Theo phần mềm chuyên dụng.
Ghi chú: Nếu hàm lượng BSA trong mẫu cần kiểm tra tính được lớn hơn giới hạn phát hiện trên của kit thì phải tiếp tục pha loãng tiếp mẫu và làm lại thử nghiệm. Trường hợp pha loãng mẫu quá nhiều cũng dẫn tới kết quả âm tính hoặc cho giá trị nhỏ hơn giới hạn phát hiện của kit, cần phải tính toán lại độ pha (thậm chí không pha loãng) mẫu rồi làm lại thử nghiệm.
TIÊU CHUẨN CHẤP THUẬN
Hàm lượng BSA tồn dư trong mẫu phải nằm trong giới hạn cho phép đối với từng vắc xin hoặc nằm trong giới hạn nhà sản xuất đăng ký.