INTERFERON ALPHA 2 (Interferoni alfa 2) – Dược điển Việt Nam 5

Interferon alpha 2 là sinh phẩm ở dạng lỏng hoặc đông khô có chứa interferon alpha-2 người, tái tổ hợp.
Interferon alpha 2 dạng lỏng là dung dịch trong suốt, không màu.
Interferon alpha 2 đông khô có dạng khối xốp, trắng mịn, dễ hòa tan trong nước thành dung dịch trong suốt.
Interferon alpha 2 được dùng để kháng virus, ức chế tăng sinh tế bào ung thư và có chức năng điều hòa miễn dịch.

Sản xuất

Interferon alpha 2 được sản xuất theo công nghệ tái tổ hợp ADN: Gen mã hoá interferon alpha 2 được tách từ tế bào lympho của người và đưa vào vector biểu hiện; Sau đó vector này được đưa vào vi khuẩn. Vi khuẩn này được nuôi cấy trong môi trường đặc biệt để thu sinh khối và sau đó dùng kỹ thuật sinh hoá tách chiết và tinh sạch interferon alpha 2. Sản phẩm được đóng ống hoặc đông khô với hàm lượng interferon alpha 2 khác nhau tùy theo mục đích sử dụng.

Xem thêm: HUYẾT THANH KHÁNG BẠCH HẦU – Dược điển Việt Nam 5

Nhận dạng

Interferon alpha 2 được nhận dạng thông qua sự giảm hoạt tính kháng virus của nó trên tế bào nhiễm sau khi trung hòa với kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2.

Vật liệu

Interferon alpha 2 thử nghiệm.
Kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2.
Tế bào MDBK (Madin-Darby Bovin Kidney – Tế bào thận bò).
Virus gây nhiễm VSV (Vesicular Stomatitis Virus – Virus gây viêm vòm họng) đã chuẩn độ.
Môi trường MEM (Minimum Essential Medium) có chứa huyết thanh bào thai bê (Fetal Bovin Serum, FBS). Dung dịch trypsin 0,25 %.
Phiến nhựa vô trùng, 96 giếng, đáy bằng.

Phương pháp tiến hành

Ngày thứ 1:
Pha kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2 với môi trường MEM 2 % FBS để có dung dịch chứa 200 IU/ml.
Trộn đều 3 lọ đến 5 lọ mẫu thử nghiệm và pha loãng bằng MEM 2 % FBS để có dung dịch chứa khoảng 200 IU/ml (tùy vào hàm lượng interferon alpha 2 ghi trên nhãn).

Trung hoà: Trộn đều 1 ml interferon alpha 2 đã pha loãng ở trên với 1 ml kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2.

Ủ ở 37 °C trong 60 min.
Nhỏ 100 µl môi trường MEM 5 % FBS vào tất cả các giếng. Nhỏ 100 µl dung dịch mẫu thử nghiệm đã pha loãng ở trên vào giếng thứ nhất của phiến (A1). Pha loãng tiếp bậc 2 cho đến hàng giống thứ 12 (A12), loại bỏ 100 µl ở giếng A12. Nhỏ 100 µl dung dịch mẫu thử nghiệm đã trung hòa với kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2 vào hàng giếng thứ hai của phiến (B1). Pha loãng tiếp bậc 2 cho đến hàng giếng thứ 12 (B12), loại bỏ 100 µl ở giếng B12. Nhỏ 100 µl dung dịch tế bào MDBK có nồng độ 6 × 10⁵ đến 8 × 10⁵ tế bào /ml vào toàn bộ các giếng.
Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ấm 37 °C, 5 % CO₂ trong vòng 18 h đến 24 h.
Ngày thứ 2:
Kiểm tra sự phát triển của tế bào MDBK ở các giống tế bào chứng, tế bào phải mọc được một lớp kín.
Loại bỏ nước nổi trong tất cả các giếng của phiến.
Pha dung dịch virus gây nhiễm VSV với môi trường MEM 2 % FBS để có chứa 100 đến 200 CCIDs/ml. Nhỏ 100 ul dung dịch virus gây nhiễm VSV này vào tất cả các giếng. Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ủ ở tủ ấm 37 °C, 5 % CO₂ trong vòng 18 h đến 24 h.
Ngày thứ 3:
Kiểm tra sự hủy hoại của tế bào nhiễm virus dưới kính hiển vi ở các giếng nhỏ dung dịch interferon alpha 2 sau trung hòa, tỷ lệ hủy hoại tế bào phải đạt trên 90%.

Nhuộm tế bào với tím gentian: Thêm 50 µl dung dịch tím tinh thể (TT) vào mỗi giếng, trộn đều, để yên 10 min. Loại bỏ dung dịch tím tinh thể còn dư, rửa phiến bằng nước. Để phiến khô ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 50 ul 2-methoxyethanol vào tất cả các giếng. Lắc nhẹ phiến trên máy lắc trong vòng 10 min. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc ELISA.
Tiêu chuẩn đánh giá. So sánh độ hấp phụ giữa các giếng tương ứng của 2 loại dung dịch thử nghiệm trước và sau khi trung hòa với kháng thể đơn dòng kháng interferon alpha 2: Độ hấp thụ của các giếng sau trung hoà phải nhỏ hơn.

Hiệu giá

Hiệu giá interferon alpha 2 được xác định bằng chuẩn độ hoạt tính kháng virus của mẫu thử nghiệm trên tế bào MDBK.
Hiệu giá của Interferon alpha 2 thử nghiệm được tính theo mẫu chuẩn quốc tế interferon alpha 2 tái tổ hợp.

Vật liệu

Interferon alpha 2 chuẩn quốc tế.
Interferon alpha 2 thử nghiệm.

Tế bào MDBK.
Virus gây nhiễm VSV đã chuẩn độ.
Môi trường MEM có chứa huyết thanh bào thai bê.

Phiến nhựa vô trùng, 96 giếng, đáy bằng.

Phương pháp tiến hành

Ngày thứ 1:
Pha loãng mẫu chuẩn quốc tế với MEM 2 % FBS để có dung dịch chứa 100 IU/ml.

Trộn đều 3 lọ đến 5 lọ mẫu thử nghiệm và pha loãng bằng MEM 2 % FBS để có dung dịch chứa khoảng 100 IU/ml (tùy vào hàm lượng interferon alpha 2 ghi trên nhãn).
Nhỏ 100 µl môi trường MEM 5 % FBS vào tất cả các giếng. Nhỏ 100 µl dung dịch đã pha loãng của mẫu chuẩn quốc tế (MCQT) và mẫu thử nghiệm vào mỗi giếng trong cột thứ nhất của phiến. Đối với MCQT nhỏ 2 giếng (B1, C1) và mẫu thử nghiệm nhỏ 5 giếng (D1, E1, F1, G1, H1).
Pha loãng bậc 2 liên tiếp cho đến cột thứ 12 thi loại bỏ 100 μl.
Nhỏ 100 µl dung dịch tế bào MDBK có nồng độ (6-8) x 10⁵ tế bào/ml vào toàn bộ các giếng.
Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ấm 37°C,5% CO₂ trong vòng 18 h đến 24h.
Ngày thứ 2:
Kiểm tra sự phát triển của tế bào MDBK ở các giếng chứng “tế bào” (giếng A1 đến A6), tế bào phải mọc được một lớp kín.
Loại bỏ nước nổi trong tất cả các giếng của phiến.
Pha dung dịch virus gây nhiễm VSV với môi trường MEM 2% FBS để có chứa 100 đến 200 CCIDs/ml. Nhỏ 100 µl dung dịch virus gây nhiễm VSV vào tất cả các giếng trừ giếng chứng “tế bào”.
Phủ giấy dán, đậy nắp phiến và để ở tủ ẩm 37 °C,5 % CO₂ trong vòng 18 h đến 24 h.

Ngày thứ 3:

Kiểm tra sự hủy hoại của virus đối với tế bào dưới kính hiển vi, ở các giếng chứng “virus” (giếng A7 đến A12) tỷ lệ hủy hoại phải đạt trên 90 %.
Nhuộm tế bào với tím gentian: Thêm 50 ul dung dịch tím tinh thể (TT) vào mỗi giếng, trộn đều, để yên 10 min. Loại bỏ dung dịch tím tinh thể còn dư, rửa phiến bằng nước. Để phiến khô ở nhiệt độ phòng. Nhỏ 50 ul 2-methoxyethanol vào tất cả các giếng. Lắc nhẹ phiến trên máy lắc trong vòng 10 min. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc ELISA.
Tính kết quả:
Tính độ hấp thụ 50 % theo công thức:

A₅₀ = (A_c + A_v )/2

Trong đó:
A_c là độ hấp thụ trung bình của các giếng chứng “tế bào”;

A_v là độ hấp thụ trung bình của các giếng chứng “virus”.

Xác định hiệu quả bảo vệ 50 % tế bào của interferon alpha 2 mẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn quốc tế theo công thức N=n + (A_n -A₅₀)/(A_n – A_n+1)
Trong đó:
N là số thứ tự của giếng có độ bảo vệ tế bào 50 %;

n là số thứ tự của giếng có độ hấp thụ >50%;

A_n là độ hấp thụ của giếng thứ “n”;
A_n+1 là độ hấp thụ của giếng thứ “n+1”.

Tính hiệu giá theo công thức:
Hiệu giá (%) = 100 × 2 ^{(Ntn – Ns)}

Trong đó:
Ntn là vị trí giếng mà ở đó interferon alpha 2 thử nghiệm bảo vệ được 50 % tế bào;
Ns là vị trí giếng mà ở đó interferon alpha 2 chuẩn quốc tế bảo vệ được 50 % tế bào.

Tiêu chuẩn đánh giá

Mẫu interferon alpha 2 thử nghiệm chỉ đạt yêu cầu khi hiệu giá tính được phải đạt từ 70 % đến 150 % hàm lượng ghi trên nhãn.

An toàn chung

Với liều tiêm là 15 triệu IU/5 ml đối với 1 chuột lang và 1 triệu IU/0,5 ml đối với 1 chuột nhắt (Phụ lục 15.11).

Chất gây sốt

Mẫu interferon alpha 2 thử nghiệm được pha loãng với nước muối hồi chỉnh, để có nồng độ 600 000 IU/ml (Phụ lục 15.12).

Vô khuẩn

Đạt vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Độ ẩm tồn dư

(đối với dạng đông khô)

Không lớn hơn 3 % (Phụ lục 15.35).

pH

7,0 ± 0,5 (Phụ lục 15.33).

Xem thêm: HUYẾT THANH MIỄN DỊCH DÙNG CHO NGƯỜI (Immunosera ad usunt humanum)- Dược điển Việt Nam 5

Đóng gói, bảo quản

Đóng gói: Hàm lượng interferon alpha 2 được đóng gói tùy theo nhà sản xuất: 3 triệu IU/lo, 4,5 triệu IU/lọ. 6 triệu IU/lọ; 90 g/lọ, 180 µl /lọ, kèm theo nước hồi chỉnh.

Interferon alpha 2 đông khô phải bảo quản ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng.

Nhãn, hộp

Những thông tin đối với nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu quy định hiện hành.