VẮC XIN BẠCH HẦU, UỐN VÁN, HO GÀ, VIÊM GAN B VÀ Hib (DTwP-HeB-Hib) (Vaccinum diphtheriae, tetani, pertussis, hepatitidis B et haemophili stirpis b coniugatum adsorbatum) – Dược điển Việt Nam 5

Vắc xin bạch hầu, uốn ván, ho gà, viêm gan B và Hib là một hỗn hợp các kháng nguyên hấp phụ vào tá chất nhôm, gồm các giải độc tố bạch hầu, uốn ván tinh chế, vắc xin ho gà toàn tế bào, kháng nguyên bề mặt (HBsAg) virus viêm gan B tái tổ hợp và kháng nguyên Hib cộng hợp. Tá chất là nhôm.

Sản xuất giải độc tố bạch cầu

Vắc xin bạch hầu được sản xuất dựa vào hệ thống chủng gốc. Chủng Corynebacterium diphtheriae dùng cho sản xuất phải tuân thủ theo quy định về hệ thống chủng gốc và được nuôi cấy trên môi trường lỏng Lingood. Cuối giai đoạn nuôi cấy, cần kiểm tra tính thuần khiết để loại bỏ những loạt nuôi cấy đơn bị nhiễm tạp. Xác định hàm lượng độc tổ bạch hầu (Lf/ml) bằng phản ứng lên bông. Các mẻ gặt đơn có thể hỗn hợp lại để giải độc bằng formaldehyd và tinh chế theo phương pháp thích hợp.
Giải độc tố bạch hầu tinh chế được kiểm tra vô khuẩn, tính độc đặc hiệu, tính hồi độc, độ tinh sạch của kháng nguyên trước khi pha chế vắc xin bản thành phẩm cuối cùng.

Vô khuẩn

Tiến hành thử nghiệm vô khuẩn trên môi trường canh thang Thioglycolat và Soybean Casein với 10 ml mẫu giải độc tố bạch hầu tinh chế cho mỗi môi trường.
Cách tiến hành và tiêu chuẩn chấp thuận theo Phụ lục 15.7.

Kiểm tra tính độc đặc hiệu

Tiêm dưới da ít nhất 500 Lf của giải độc tố bạch hầu tinh chế chứa trong thể tích 1 ml vào mỗi trong số 5 chuột lang khối lượng 250 g/con đến 350 g/con, khỏe mạnh, chưa sử dụng vào bất cứ mục đích gì trước đó. Theo dõi chuột trong vòng 42 ngày sau tiêm, nếu thấy chuột có những triệu chứng bất thường hay bị chết do độc tố bạch hầu thì lô giải độc tế bạch hầu tinh chế này không đạt về tính an toàn đặc hiệu. Nếu có hơn một chuột lang thử nghiệm bị chết trong thời gian theo dõi vì bất kỳ nguyên nhân nào không phải do độc tố bạch hầu thì phải nhắc lại thử nghiệm. Nếu có hơn một chuột lang thử nghiệm bị chết trong lần thử nghiệm thứ hai thì lô giải độc tố bạch hầu tinh chế này không đạt về tính an toàn đặc hiệu.

Kiểm tra tính hồi độc

Sử dụng dung dịch đệm giống như dùng để pha vắc xin thành phẩm nhưng không có chất hấp phụ để pha loãng giải độc tố bạch hầu tinh chế sao cho có chứa hàm lượng giải độc tố tương đương như trong vắc xin thành phẩm (35 Lf/ml); chia thành 2 phần tương đương nhau và ủ mỗi phần của dung dịch này ở nhiệt độ khác nhau (5 ± 3)°C và 37°C trong 6 tuần. Từng mẫu trong 2 mẫu thử sau khi ủ được đưa ra kiểm tra tính hồi độc của độc tố bạch hầu bằng cách tiêm dưới da cho 5 chuột lang khỏe mạnh, khối lượng từ 250 g/con đến 350 g/con.
Giải độc tố bạch hầu tinh chế đạt yêu cầu về thử nghiệm tính hồi độc khi các chuột lang thử nghiệm đều khỏe mạnh, lên cân và không có chuột nào có dấu hiệu về phản ứng do độc tố bạch hầu trong 6 tuần theo dõi.

Kiểm tra độ tinh sạch của kháng nguyên hạch hầu

Giải độc tố bạch hầu tinh chế phải đạt không ít hơn 1500 Lf/mg nitrogen protein.

Sản xuất giải độc tố uốn ván

Vắc xin uốn ván được sản xuất dựa vào hệ thống chủng gốc. Chủng Clostridium tetani dùng cho sản xuất phải tuân thủ theo quy định về hệ thống chủng gốc và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Cuối giai đoạn nuôi cấy, cần kiểm tra tinh thuần khiết để loại bỏ những loạt nuôi cấy đơn bị nhiễm tạp. Xác định hàm lượng độc tố uốn ván (Lf/ml) bằng phản ứng lên bông, xác định độc tính bằng thử nghiệm liều chết 100% chuột (MLD). Các mẻ gặt đơn có thể hỗn hợp lại để giải độc bằng formaldehyd và nhiệt độ, tinh chế theo phương pháp thích hợp.
Số lượng Lf trong vắc xin uốn ván bán thành phẩm tùy thuộc vào công thức gốc của từng nhà sản xuất nhưng không được quá 25 Lf trong một liều đơn cho người, nếu sử dụng nhiều hơn một liều cho phác đồ tiêm miễn dịch cơ bản.
Giải độc tố uốn ván tinh chế được kiểm tra vô khuẩn, tính độc đặc hiệu, tính hồi độc, độ tinh sạch, hàm lượng kháng nguyên (Lf/ml) trước khi pha chế vắc xin bản thành phẩm cuối cùng.

Vô khuẩn

Tiến hành thử nghiệm vô khuẩn trên môi trường canh thang Thioglycolat và Soybean Casein với 10 ml mẫu giải độc tố uốn ván tinh chế cho mỗi môi trường.
Cách tiến hành và tiêu chuẩn chấp thuận theo Phụ lục 15.7.

Tính độc đặc hiệu

Tiêm dưới da ít nhất 500 Lf của giải độc tố uốn ván tinh chế chứa trong thể tích 1 ml vào mỗi chuột trong số 5 chuột lang khỏe mạnh, khối lượng 250 g/con đến 350 g/con chưa sử dụng vào bất cứ mục đích gì trước đó. Theo dõi chuột trong vòng 21 ngày sau tiêm, nếu thấy chuột có những triệu chứng bất thường hay bị chết do độc tổ uốn ván thì lô giải độc tố uốn ván tinh chế này không đạt về tính an toàn đặc hiệu. Nếu có hơn một chuột lang thử nghiệm bị chết trong thời gian theo dõi vì bất kỳ nguyên nhân nào không phải do độc tố uốn ván thì phải nhắc lại thử nghiệm. Nếu có hơn một chuột lang thử nghiệm bị chết trong lần thử nghiệm thứ hai thì lô giải độc tố uốn ván tinh chế này cũng không đạt về tính an toàn đặc hiệu.

Tính hồi độc

Sử dụng dung dịch đệm dùng để pha vắc xin thành phẩm nhưng không có chất hấp phụ để pha loãng giải độc tố uốn ván tinh chế sao cho có chứa hàm lượng giải độc tố tương đương như trong vắc xin thành phẩm (< 20 Lf/ml); chia thành 2 phần tương đương nhau và ủ mỗi phần của dung dịch này ở nhiệt độ khác nhau (5 ± 3)°C và 37°C trong 6 tuần. Từng mẫu trong 2 mẫu thử sau khi ủ được đưa ra kiểm tra tính hồi độc của độc tố uốn ván bằng cách tiêm dưới da cho 5 chuột lang khỏe mạnh, khối lượng từ 250 g/con đến 350 g/con.
Giải độc tố uốn ván tinh chế đạt yêu cầu về thử nghiệm tính hồi độc khi các chuột lang thử nghiệm đều khỏe mạnh, lên cân và không có chuột nào có dấu hiệu về phản ứng do độc tố uốn ván trong 3 tuần theo dõi.

Độ tinh sạch của kháng nguyên uốn ván

Giải độc tố uốn ván tinh chế phải đạt không ít hơn 1000 Lf/mg nitrogen protein.

Sản xuất nước cốt ho gà bất hoạt

Nước cốt ho gà được sản xuất dựa vào hệ thống chủng gốc. Chủng Bordertella pertussis dùng cho sản xuất phải tuân thủ theo quy định về hệ thống chủng gốc và được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Việc lựa chọn chủng nuôi cấy, môi trường và phương pháp nuôi cấy thích hợp nhằm tạo ra vắc xin ho gà thành phẩm có được 3 ngưng kết nguyên: 1; 2; 3. Từng chủng được nuôi cấy 24 h đến 72 h trong môi trường lỏng hoặc đặc. Không được dùng máu người hoặc các sản phẩm từ máu người trong bất kỳ môi trường nuôi cấy chủng ho gà nào để sản xuất vắc xin ho gà. Môi trường dùng trong giai đoạn nuôi cấy chủng ho gà cuối cùng cũng không được phép có máu hoặc sản phẩm của máu.
Sau khi nuôi cấy, gặt và rửa sinh khối vi khuẩn ho gà để loại bỏ các chất còn tồn dư của môi trường nuôi cấy, pha thành hỗn dịch ho gà với nước muối sinh lý vô khuẩn thành hỗn dịch nước cốt ho gà cô đặc.

Tính thuần khiết của các mẻ gặt đơn

Lấy mẫu từ các mẻ gặt đơn để kiểm tra tính thuần khiết bằng phương pháp nhuộm soi kính hiển vi hoặc cấy vào môi trường nuôi cấy thích hợp. Các mẻ gặt đơn sẽ không được phép sử dụng vào việc pha chế bán thành phẩm khi phát hiện có tạp nhiễm.

Độ đục

Dùng bộ so độ đục chuẩn quốc tế hoặc đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 560 nm của hỗn dịch nước cốt ho gà cô đặc (không được muộn hơn hai tuần sau khi gặt và trước khi huyền dịch vi khuẩn được đưa vào bất kỳ quy trinh pha chế nào tiếp theo) để xác định đậm độ của nước cốt ho gà cô đặc. Đậm độ nước cốt ho gà được sử dụng làm cơ sở để tính toán khi pha chế vắc xin bản thành phẩm cuối cùng. Thành phần ho gà trong vắc xin DTP_w – HeB – Hib hỗn hợp không vượt quá 15 đơn vị độ đục quốc tế (IOU) trong một liều đơn vắc xin cho người. Tỷ lệ thành phần các chủng B. pertussis không được thay đổi khi hỗn hợp vắc xin, phải đăng ký rõ trong hồ sơ và được sự chấp thuận của cơ quan kiểm định quốc gia.

Độ sống sót

Hỗn dịch vi khuẩn ho gà được giết chết và giải độc bằng phương pháp được sự chấp thuận của cơ quan kiểm định quốc gia. Các hóa chất được sử dụng để giết chết và giải độc vi khuẩn ho gà cũng phải được sự chấp thuận bởi cơ quan kiểm định quốc gia. Hỗn dịch vi khuẩn ho gà được giết chết bằng nhiệt độ trong khoảng thời gian thích hợp và được kiểm tra sự sống sót của các vi khuẩn này trên môi trường Border-Gengou. Sau khi bất hoạt, nước cốt ho gà được bảo quản ở nhiệt độ (5 ± 3)°C trong một khoảng thời gian cần thiết để giảm bớt tính độc.
Mỗi loạt nước cốt ho gà đơn sẽ không được dùng để pha chế vắc xin bán thành phẩm khi không đạt các tiêu chuẩn về vô khuẩn, khả năng bất hoạt hoàn toàn (kiểm tra độ sống sót), nhận dạng, khả năng phát triển, ngưng kết như chủng gốc B. pertussis.
Sản xuất kháng nguyên bề mặt (HBsAg) tái tổ hợp Vắc xin viêm gan B tái tổ hợp được điều chế bằng cách sử dụng HBsAg tổng hợp ở tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha), tế bào trứng chuột đất vàng (CHO-Chinese hamster ovary) hoặc các dòng tế bào thích hợp khác đã được biến nạp một plasmid có chứa gen mã hóa HBsAg. HBsAg được thu từ tế bào bằng cách làm ly giải tế bào nấm men và được tinh chế nhờ các kỹ thuật sinh hóa lý.
Vắc xin tái tổ hợp có thể chứa sản phẩm của gen S (protein chủ yếu) hoặc phối hợp sản phẩm của gen S và tiền S₂ (protein loại trung bình) hoặc phối hợp cả sản phẩm của gen S, tiền S₂ , và tiền S₁, (protein loại lớn).

Hàm lượng protein

Protein trong mẫu thử được định lượng theo phương pháp Lowry (Phụ lục 15.34)

Nhận dạng và hàm lượng HBs4g

Xác định hàm lượng HBsAg bằng các thử nghiệm hóa miễn dịch phù hợp, như thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), thẩm miễn dịch hoặc khuếch tán miễn dịch đơn. Vắc xin mẫu thử được so sánh với vắc xin mẫu chuẩn quốc tế hoặc vắc xin mẫu chuẩn.

Độ tinh khiết của kháng nguyên

Được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng.

Lipid

Không lớn hơn 100 µg/100 µg protein (Phụ lục 15.40).

Cesi clorid

Không lớn hơn 5 µg/ 20µg protein (Phụ lục 15.41).

Tween 20

Không lớn hơn 50 µg/100 µg protein (Phụ lục 15.6).

Polysaccharid

Không lớn hơn 10 µg/100 µg protein (Phụ lục 15.38). Kiểm định vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Thimerosal

Không được lớn hơn 0,012 % (Phụ lục 15.29).

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu về vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Sản xuất kháng nguyên Hib cộng hợp

Vắc xin phòng Hemophilus influenzae type b là loại vắc xin hóa học được điều chế từ oligosaccharid tổng hợp giống với thành phần vỏ polysaccharid của vi khuẩn trong tự nhiên. Oligosaccharid cộng hợp với protein của giải độc tố uốn ván làm giá mang.
Trong mỗi liều đơn tiêm cho người chứa thành phần hoạt chất: Kháng nguyên PRP-T: 12 µg.

Nhận dạng thành phần Hib

Bằng phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu trong hệ thống hạt Latex. Sử dụng bộ sinh phẩm đáp ứng được yêu cầu nhận dạng và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất bộ sinh phẩm Latex, hoặc nhận dạng thành phần Hib bằng một phản ứng hóa miễn dịch phù hợp. Tiêu chuẩn: Có hiện tượng ngưng kết xảy ra, nhận thấy rõ rằng bằng mắt thường.

Hàm lượng saccharid (Polyribosyl Ribitol Phosphat = PRP) tổng số

Xác định hàm lượng PRP tổng số bằng phương pháp orcinol (Phụ lục 15.42) hoặc phương pháp sắc ký lỏng. Tiêu chuẩn: Ít nhất phải đạt 80 % của hàm lượng saccharid tổng số ghi trên nhãn.

Hàm lượng saccharid tự do

Không được quả 25,0 % (≤ 25,0 %).
Xác định hàm lượng saccharid tự do bằng phương pháp orcinol (Phụ lục 15.42) hoặc phương pháp sắc ký lỏng.

Xác định hoạt tính miễn dịch Hib

Sinh vật phẩm:
Thỏ cái F1 (1,8 kg đến 2,2 kg) được lựa chọn, vận chuyển và chăm sóc trong điều kiện thường. Chứng dương vắc xin Hib.
Chuẩn bị dung dịch:
Dung dịch 20xPBS (20 × Phosphate Buffer Saline): Dung dịch có chứa 2,74 M natri clorid (TT), 0,054 M kali clorid (TT), 0,16 M dinatri hydrophosphat (TT) và 0,028 M kali dihydrophosphat (TT). Cần 320 g natri clorid (TT), 8 g kali clorid (TT), 46 g dinatri hydrophosphat (TT), 8 g kali dihydrophosphat (TT). Hòa tan trong 1500 ml nước cất. Điều chỉnh pH trong khoảng từ 7,2 đến 7,3 bằng dung dịch acid hydrocloric 37 % (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd
2 M(TT). Chuyển vào binh định mức 2 L, thêm nước cất vừa đủ đến vạch. Dung dịch này có nồng độ gấp 20 lần dung dịch làm việc. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dùng trong vòng 1 tháng.
Dung dịch PBS: Pha loãng 20 lần dung dịch 20×PBS bằng nước cất, cụ thể như sau: Lấy 100 ml dung dịch 20×PBS vào bình định mức 2 L, thêm nước cất đến vạch, lắc đều. Nếu cần, điều chỉnh pH trong khoảng từ 7,2 đến 7,3 bằng dung dịch acid hydrocloric 37 % (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 N (TT). Bảo quản ở 4 °C, dùng trong vòng 15 ngày.
Tiến hành:
Làm song song mẫu thử và mẫu chứng.
Liều vắc xin 10 µg/0,5 ml.
Gây nhiễm trên 5 thỏ mỗi mẫu với liều vắc xin 10 µg/0,5 ml. Nếu vắc xin có hàm lượng cao hơn thì phải pha loãng bằng dung dịch PBS, sử dụng các vật liệu tiệt trùng.
Nếu vắc xin có hàm lượng thấp hơn, gây nhiễm với thể tích tiêm lớn hơn để đủ 10 µg nhưng không quá 2,5 ml mỗi thỏ.
Gây nhiễm ở ngày 0 và ngày 14, bằng đường tiêm dưới da vùng bụng. Sau khi tiêm theo dõi trong vòng 28 ngày ở vùng cách ly bảo vệ,
Tiến hành lấy máu sau liều tiêm đầu tiên 21 ngày. Lấy máu riêng từng con vào ống nghiệm nhựa 15 ml, không ít hơn 5 ml. Ly tâm 3000 r/min trong 20 min ở nhiệt độ phòng. Tách huyết thanh cẩn thận bằng pipet (không được làm lẫn huyết thanh giữa các ống khác nhau) sang một ống nghiệm khác. Nếu chưa tiến hành định lượng kháng thể anti-Hib ngay, bảo quản các mẫu huyết thanh ở -20 °C để kiểm tra sau.

Xem thêm: HUYẾT THANH MIỄN DỊCH DÙNG CHO NGƯỜI (Immunosera ad usunt humanum)- Dược điển Việt Nam 5

Định lượng kháng thể trong huyết thanh sau khi ly tâm theo quy trình định lượng kháng thể kháng Hib bằng phương pháp ELISA

Thiết bị:
Máy đọc ELISA, bước sóng 492 nm.
Tủ an toàn sinh học.
Rửa phiến nhựa ELISA.
Máy đo ELISA đa kênh.
Vật liệu:
Phiến nhựa 96 giếng chuẩn độ vi lượng.
Buồng ẩm (hộp kín bằng nhựa hoặc kim loại bên trong có lót giấy lọc thấm nước cất để tạo độ ẩm).
Thuốc thử:
Tween 20
BSA Fraction V
OPD
Kháng IgG thỏ cộng hợp gắn peroxidase.
Chứng âm huyết thanh anti-Hib.
Chứng dương huyết thanh thỏ anti-Hib.
Oligosaccharid của Hib cộng hợp với HSA (phủ phiến) (HbỌ-HSA).
Chuẩn bị dung dịch:
Dung dịch 20×PBS: Pha như trên.
Dung dịch đệm phosphat-citrat có chứa 0.048 M acid citric (TT), 0,1 M dinatri hydrophosphat (TT).
Dung dịch rửa phiến có chứa 0,027 M kali clorid (TT), 0,137 M natri clorid (TT), 0,008 M dinatri hydrophosphat (TT), 0,0014 M dikali hydrophosphat (TT), 0,05 % Tween 20, được pha bằng cách: thêm 2,5 ml Tween 20 vào 5 L dung dịch PBS. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dùng trong vòng 7 ngày.
Tween 20 pha loãng 1/4: Để có 40 ml dung dịch, lấy 10 ml Tween 20 thêm 30 ml nước cất. Trộn đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng, dùng trong vòng 1 tháng.
Dung dịch dừng phản ứng: Cân 10 g natri metabisulfit (TT), hòa tan trong 840 ml nước cất, thêm từ từ 160 ml acid sulfuric (TT). Khuấy đều, đặt trong chậu đá. Pha trong hốt và mang găng. Bảo quản ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 tháng.
Dung dịch khóa (chứa 1 % BSA) Pha trước khi dùng. Cân 0,2 g BSA, hòa tan trong 20 ml nước cất.
Dung dịch pha loãng cho ELISA anti-Hib: Cân 1 g BSA, 0,372 g natri edetat (TT), đong 1,2 ml Tween 20 pha loãng 1/4, tất cả được hoà tan trong 80 ml dung dịch PBS. Điều chỉnh pH từ 7,2 đến 7,3 bằng dung dịch acid hydrocloric 37 % (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 2 N (TT) nếu cần. Thêm dung địch PBS vừa đủ 100 ml. Bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, dùng trong vòng 1 tháng. Tiến hành:
Chuẩn bị chứng dương huyết thanh thỏ (anti-Hib) và chứng âm huyết thanh cho thử nghiệm ELISA theo cách sau: Pha loãng 1/50 với dung dịch pha loãng. Loại bỏ hết các vật liệu đã sử dụng. Chú ý: Tất cả phải ủ trong tủ ẩm. Sau khi rửa phiến, nếu chưa dùng ngay, để ngửa phiến trong tủ ẩm, không quá 15 min.
Pha loãng dung dịch phủ phiến HBO-HSA để được nồng độ cuối cùng là 1 ng/ml HBO-HSA trong PBS với thể tích 11 ml. Thể tích này đủ dùng cho 1 phiến 96 giếng.
Ủ phiến ở 37 °C trong 90 min hoặc qua đêm ở 4 C. Rửa phiến 3 lần với dung dịch đệm rửa.
Thêm 100 ul dung dịch khóa vào mỗi giếng. Ủ phiến trong 30 min ở 37 °C.
Rửa phiến 3 lần với dung dịch rửa phiến. Thiết kế phiên:
Thể tích của mẫu và chứng trong mỗi giếng là 100 µl. Cho chứng dương và chúng âm ở cột 1, 2 từ hàng A đến H (lặp lại 4 lần).
Cho mẫu từ cột 3 trở đi từ hàng A đến hàng H lặp lại 2 lần. Ủ phiến 90 min ở nhiệt độ phòng.
Rửa phiến 3 lần với dung dịch rửa phiến.
Pha loãng cộng hợp kháng huyết thanh thỏ với peroxidase bằng dung dịch pha loãng theo hướng dẫn của nhà cung cấp. Sau đó thêm 100 µl dung dịch vừa pha vào tất cả các giếng. Ủ phiến 1 h ở 37 °C.
Rửa phiến 3 lần với dung dịch rửa phiến.
Chuẩn bị dung dịch cơ chất như sau: Cân 0,1 g OPD và hòa tan trong 25 ml dung dịch đệm phosphat – citrat trong điều kiện tránh ánh sáng. Thêm 10 ml H₂O₂, lắc đều và thêm 100 µl vào tất cả các giếng.
Ủ 5 min trong tối ở nhiệt độ phòng.
Dừng phản ứng bằng cách thêm 50 µl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
Đọc phiến ở bước sóng 492 nm (Multiscan).
Phân tích và biện luận kết quả:
Thử nghiệm được chấp thuận khi OD của chứng dương và chứng âm đều nằm trong dải đo đã thiết lập. Nếu quá nửa bị loại, lặp lại test ELISA.
Tính toán giá trị ngưỡng (cutoff) của thử nghiệm để thiết lập tiêu chuẩn quyết định mẫu âm tính hay dương tính theo công thức:
Cutoff = trung bình OD của nền + 2SD
Trong đó: SD là độ lệch chuẩn.
Tất cả các giá trị OD lớn hơn hoặc bằng Cutoff là dương tính. Tất cả các giá trị OD nhỏ hơn cutoff là âm tính.
Tính % có đáp ứng như sau:
% đáp ứng = Tổng số thỏ có đáp ứng x 100/ Tổng số thỏ có gây nhiễm
Tiêu chuẩn chấp thuận của thử nghiệm:
Thử nghiệm có giá trị khi đối với mẫu vắc xin chứng, số thỏ có đáp ứng miễn dịch không ít hơn 50% (50%). Tiêu chuẩn chấp thuận của mẫu thử:
Mẫu thử được coi là đạt yêu cầu của thử nghiệm khi số thỏ được dùng trong thử nghiệm có đáp ứng miễn dịch không ít hơn 50 % (250 %).
Phương pháp sản xuất vắc xin DTPw – HeB – Hib phải được thẩm định để chứng minh rằng sản phẩm khi kiểm định sẽ tuân thủ và đạt được các tiêu chuẩn như mô tả dưới đây.

Kiểm định vắc xin bán thành phẩm

Vắc xin bán thành phẩm được pha chế và hỗn hợp bởi một lượng thích hợp của giải độc tố bạch hầu, giải độc tố uốn ván, kháng nguyên viêm gan B đã được hấp phụ nhôm phosphat và hỗn hợp thêm một lượng thích hợp của huyền dịch B. pertussis đã được bất hoạt, sau cùng được hỗn hợp với kháng nguyên Hib đã được hấp phụ nhôm phosphat; kết quả của sự hỗn hợp này được tiêm vào cơ thể phải phù hợp về mặt sinh lý với mẫu. Hàm lượng của B. pertussis của vắc xin bán thành phẩm phải không được vượt quá 15 IOU trong một liều đơn cho người. Nếu sử dụng hai hoặc nhiều hơn số chủng B. pertussis thì khi pha vắc xin bán thành phẩm phải tính toán sao cho tổng số đơn vị độ đục của các chủng ho gà đưa vào phải không thay đổi giữa các loạt vắc xin và không vượt quá 15 IOU trong một liều đơn cho người. Hàm lượng chất bảo quản trong vắc xin DTP – HeB – Hib hấp phụ phải không ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch của giải độc tố uốn ván, bạch hầu, vắc xin ho gà, kháng nguyên Hib, kháng nguyên HeB và không gây ra những phản ứng có hại cho người sử dụng. Chỉ vắc xin bán thành phẩm cuối cùng nào tuân thủ và đạt các yêu cầu dưới đây mới được sử dụng để sử dụng sản xuất thành phẩm.

Chất bảo quản kháng khuẩn

Xác định hàm lượng chất bảo quản kháng khuẩn trong vắc xin bán thành phẩm cuối cùng bằng phương pháp thích hợp (Phụ lục 15.29). Hàm lượng chất bảo quản từ 85 % đến 115 % của lượng chất bảo quản ghi trên nhãn.

Vô khuẩn

Tiến hành thử nghiệm vô khuẩn trên môi trường canh thang Thioglycolat và Soybean Casein. Dùng 10 ml vắc xin đề kiểm tra trên mỗi môi trường (Phụ lục 15.7).

Công hiệu

Tiến hành các thử nghiệm kiểm tra công hiệu theo Phụ lục 15.22; Phụ lục 15.23; Phụ lục 15.24.
Công hiệu vắc xin viêm gan B tái tổ hợp được tiến hành song song giữa vắc xin mẫu thử với vắc xin mẫu chuẩn quốc gia; có thể được xác định bằng phương pháp thực nghiệm trên động vật thí nghiệm (công hiệu in vivo) để xác định hiệu giá kháng thể, hoặc phương pháp miễn dịch trong phòng thí nghiệm (công hiệu in vitro) để xác định hàm lượng kháng nguyên HBsAg có trong vắc xin.

Thử nghiệm công hiệu in vivo

Động vật thí nghiệm
Chuột nhắt trắng giống BALB/C hoặc ICR, khỏe mạnh và từ cùng một đàn, khoảng 5 tuần đến 6 tuần tuổi, tốt nhất là chuột cùng một giới.
Xác định công hiệu tương quan
Vắc xin mẫu chuẩn quốc gia và vắc xin mẫu thử được pha loãng bậc 2 thành 5 độ pha. Dung dịch để pha vắc xin là dung dịch natri clorid 0,9 % có chứa nhôm hydroxyd (hàm lượng nhôm hydroxyd không quá 500 ng/ml), Tiêm màng bụng 1 ml mỗi độ pha loãng vắc xin cho mỗi chuột. Mỗi độ pha loãng vắc xin tiêm ít nhất 15 chuột. Tất cả các chuột sau khi gây miễn dịch được nuôi từ 28 đến 32 ngày trong điều kiện như nhau. Tiến hành gây mê và lấy máu tim chuột. Các mẫu máu được ly tâm 3000 r/min ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C, tách huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được bảo quản ở nhiệt độ âm 20 °C. Xác định hiệu giá kháng thể kháng HBsAg bằng thử nghiệm hấp thụ miễn dịch gắn men (ELISA) trên bộ sinh phẩm chẩn đoán thương mại có sẵn. Kết quả được tính theo chương trình Probit Analysis (WHO).
Thử nghiệm có giá trị khi:
ED₅₀ của vắc xin mẫu chuẩn quốc gia và vắc xin mẫu thử đều nằm trong khoảng giữa liều tiêm lớn nhất và nhỏ nhất. Phân tích thống kê cho thấy đạt yêu cầu về tuyến tính và song song.
Giới hạn độ tinh cậy của công hiệu tương quan nằm trong khoảng 33 % đến 300%.
Tiêu chuẩn công hiệu trên thực nghiệm:
Công hiệu tương quan (P = 95 %) không nhỏ hơn 1.

Thử nghiệm công hiệu in vitro

Định lượng kháng nguyên HBsAg bằng kỹ thuật ELISA.

Vật liệu:
Phiến 96 giếng.
Kit Hepanostika HBsAg Uni-Form II (Biomerieux).

Thuốc thử:
BSA (bovin serum albumin).
Kháng nguyên bề mặt virus HBV, cộng hợp.

Chuẩn bị dung dịch:
Dung dịch PBS: Pha như trong phần xác định hoạt tính miễn dịch Hib.
Dung dịch đệm (BSA 0,2%, PBS, Tween 20 0,05 %): Hòa tan 0,2 g BSA trong 100 ml dung dịch PBS, thêm 0,2 ml Tween 20. Bảo quản ở 4 °C. Dung dịch này chỉ pha khi dùng và bỏ phần còn thừa sau khi dùng xong.
Tiến hành:
Pha loãng chuẩn và mẫu để có OD trong khoảng từ 0,8 đến 1,2. Chuẩn bị lặp lại 3 lần riêng rẽ độ pha này của chuẩn và mẫu.
Làm 4 loạt độ pha 1: 2.
Chuẩn bị lặp lại 3 lần chứng Maximum và chứng Minimum (Chú ý: Chứng Minimum còn được gọi là chứng âm và chính là đệm pha mẫu. Chứng Maximum là độ pha ban đầu cao hơn nồng độ của mẫu đối chiếu).
Để xác định hàm lượng HBsAg, làm theo quy trình đã hướng dẫn của bộ kít. Tất cả các dung dịch, chứng và thuốc thử, sinh vật phẩm dùng trong thử nghiệm đều phải tương thích với mẫu và phù hợp với kỹ thuật ELISA. Tất cả các bước ủ phiến phải làm đúng theo mô tả trong quy trình.
Bố trí phiến tùy thuộc kỹ thuật viên và cỡ mẫu nhưng nên dự kiến trước.
Phân tích kết quả: Bằng chương trình Parlin, dùng “Logarit” để chuyển đổi với P = 95 %.
Tiêu chuẩn chấp thuận của thử nghiệm: Thử nghiệm được coi là có giá trị khi phân tích thống kê thỏa mãn các tiêu chuẩn về tuyến tính song song, hồi qui và có khác biệt giữa các liều.
Nếu thử nghiệm không có giá trị, phải làm lại.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Công hiệu tương quan (P = 95 %) không nhỏ hơn 0,65.

Polysaccharid

Không lớn hơn 10 µg/100 kg protein (Phụ lục 15.38).

Saccharid tổng số

Xác định hàm lượng PRP tổng số bằng phương pháp orcinol (Phụ lục 15.42) hoặc phương pháp sắc ký lỏng. Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng PRP tổng số ít nhất phải đạt 80 % của hàm lượng ghi trên nhãn.

Saccharid tự do

Xác định hàm lượng saccharid (PRP) tự do bằng phương pháp orcinol (Phụ lục 15.42) hoặc phương pháp sắc ký lỏng Tiêu chuẩn chấp thuận: Hàm lượng saccharid (PRP) tự do không được lớn hơn 25 % (≤ 25 %).

Xác định hoạt tính miễn dịch Hib (Như ở mục Sản xuất kháng nguyên Hib)

Làm song song mẫu thử và mẫu chứng
Gây nhiễm trên 5 thỏ mỗi mẫu với liều vắc xin 10 kg/ 0,5 ml. Gây nhiễm ở ngày 0 và ngày 14, bằng đường tiêm dưới da màng bụng. Sau khi tiêm theo dõi trong vòng 28 ngày ở vùng cách ly bảo vệ.
Tiến hành lấy máu sau liều tiêm đầu tiên 21 ngày. Lấy máu riêng từng con vào ống nhựa 15 ml, không ít hơn 5 ml.
Định lượng kháng thể kháng Hib bằng phương pháp ELISA. Tiêu chuẩn:  ≥ 50 % chuyển đổi huyết thanh miễn dịch.

Tính độc đặc hiệu

Tính độc đặc hiệu của vắc xin DTP – HeB – Hib được kiểm tra trên mẫu bán thành phẩm cuối cùng hay vắc xin thành phẩm khi cần thiết (Phụ lục 15,4).
Đối với thành phần bạch hầu và uốn ván
Chọn 5 chuột lang, có khối lượng 250 g/con đến 350 g/con. tiêm dưới da một lượng vắc xin tương đương với ít nhất 5 liều đơn cho người. Theo dõi chuột hàng ngày. Vắc xin đạt yêu cầu nếu không có chuột lang nào có dấu hiệu liệt uốn ván hoặc triệu chứng nhiễm độc bạch hầu và ít nhất 80 % chuột sống trong thời gian 6 tuần. Nếu có chuột chết phải mổ để kiểm tra phủ tạng về dấu hiệu nhiễm độc bạch hầu (tuyến thượng thận đỏ).
Đối với thành phần ho gà:
Dùng ít nhất 20 chuột nhắt trắng, trọng lượng 14 g đến 16 g, cùng giới (nếu có cả 2 giới cần phân chia đều trong các nhóm) cho mỗi mẫu vắc xin thử và nhóm chứng. Mỗi chuột được tiêm vào ổ bụng 0,5 ml dung dịch chứa tối thiểu nửa liều đơn vắc xin cho người. Nhóm chứng được tiêm 0,5 ml dung dịch tiêm natri clorid 0,9% (tốt nhất chứa cùng hàm lượng chất bảo quản như có trong dung dịch tiêm cho nhóm thí nghiệm). Tổng khối lượng các nhóm chuột được xác định vào 72 h và 7 ngày sau tiêm. Vắc xin đạt yêu cầu nếu đạt cả 3 tiêu chuẩn sau:
Sau 72 h tổng khối lượng chuột không ít hơn trước tiêm.

Sau 7 ngày khối lượng trung bình mỗi chuột không ít hơn 60 % so với nhóm chứng.
Số chuột chết không quá 5 % tổng số chuột đã được tiêm.

Kiểm định vắc xin thành phẩm

Nhận dạng thành phần bạch hầu – uốn ván – ho gà

Thành phần bạch hầu – uốn ván – họ gà toàn tế bào trong vắc xin DTPw – HeB – Hib hấp phụ được tách gel bằng cách cho thêm natri citrat (C6H5O7Na3.2H2O) với nồng độ 5 % ủ ở 37 °C trong 48 h. Sau đó ly tâm 2000 r/min trong 15 min. Nước nổi được dùng để nhận dạng thành phần bạch hầu và uốn ván bằng phản ứng lên bông, cặn ly tâm dùng để nhận dạng thành phần ho gà có trong vắc xin bằng phản ứng ngưng kết trên phiến kính với các huyết thanh kháng ho gà đặc hiệu (Phụ lục 15.19).

Nhận dạng thành phần Hib (Như ở mục sản xuất kháng nguyên Hib)

Phương pháp: Phản ứng ngưng kết Latex hoặc một phản ứng hóa miễn dịch phù hợp.
Tiêu chuẩn: Dương tính với kháng huyết thanh đặc hiệu.

Nhận dạng HBsAg

Nhận dạng HBsAg bằng các thử nghiệm hóa miễn dịch phù hợp, như thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA), thấm miễn dịch hoặc khuếch tán miễn dịch đơn. Vắc xin mẫu thử được so sánh với vắc xin mẫu chuẩn quốc tế hoặc vắc xin mẫu chuẩn quốc gia.

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

An toàn chung

Thử nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng và chuột lang khỏe mạnh. Tiêm vào ổ bụng cho 5 chuột nhắt trắng có khối lượng 17 g/con đến 22 g/con, mỗi con một nửa liều tiêm cho người, tiêm vào ổ bụng 2 chuột lang có khối lượng 250 g/con đến 350 g/con, mỗi con một liều tiêm cho người nhưng không quá 1 ml/con.
Vắc xin được coi là không có độc tính bất thường nếu tất cả các động vật thí nghiệm sống khỏe mạnh và lên cần trong thời gian ít nhất 7 ngày thử nghiệm và không có dấu hiệu nhiễm độc.

Công hiệu

Tiến hành kiểm tra ở mẫu vắc xin DTP – HeB – Hib thành phẩm khi chưa kiểm tra công hiệu trên vắc xin bán thành phẩm hoặc khi có chỉ định cần thiết (Phụ lục 15.22; 15.23; 15.24; 15.43).

Tính chất

Cảm quan.
Kiểm tra bằng mắt thường: Huyền dịch vắc xin chia thành 2 lớp, phần dung dịch phía trên trong suốt không màu hoặc vàng nhạt, lớp lắng cặn dưới đáy lọ có màu trắng xám. Nhanh chóng tạo huyền dịch đồng nhất sau khi lắc nhẹ, không lẫn chất lạ.
Tính chất vật lý:
Thể tích vắc xin mỗi lọ: Giới hạn cho phép chênh lệch thể tích + 10 % so với thể tích ghi trên nhãn.
Tỉ lệ loại bỏ:
Đối với vắc xin đa liều: không quá 3 %.

Đối với vắc xin liều đơn: không quá 5 %.
Không bị đông băng (tiêu chuẩn này chỉ kiểm tra sau khi bảo quản hay vận chuyển theo dây chuyền lạnh, không phải tiêu chuẩn xuất xưởng của nhà sản xuất): Lạ vắc xin mẫu thử phải có tốc độ lắng cặn chậm hơn nhiều so với lọ chứng dương và không có sự tạo hạt hay hình ảnh bông tuyết lơ lửng trong huyền dịch vắc xin hay kết thành cục sau khi lắc.

Chất bảo quản

Hàm lượng thimerosal cho phép là 0,005 % đến 0,02 % (Phụ lục 15.29).

Chất hấp phụ

Hàm lượng Al³⁺ trong vắc xin DTPw – HeB – Hib hấp phụ từ 0.55 mg/ml đến 0,77 mg/ml; Hàm lượng nhôm phosphat từ 2,5 mg/ml đến 3,5 mg/ml (Phụ lục 15.27).

pH

6,0 đến 7,0 (Phụ lục 15.33).

Formaldehyd tồn dư

Không được quá 0,02 % (Phụ lục 15.25).

Bảo quản, hạn dùng

Bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C vắc xin có thể giữ công hiệu 2,5 năm.

Nhà sản xuất phải đưa ra khuyến cáo về điều kiện bảo quản và vận chuyển vắc xin DTPw – HeB – Hib hấp phụ để đảm bảo rằng vắc xin đạt công hiệu theo yêu cầu cho đến khi hết hạn sử dụng như đã đăng ký và ghi trên nhãn. Vắc xin DTPw – HeB – Hib hấp phụ phải được bảo quản sao cho không bị đông băng.
Hạn dùng của vắc xin phải được cơ quan kiểm định quốc gia chấp thuận và cố định, dựa vào các số liệu nghiên cứu tính ổn định của vắc xin và không được quá 2,5 năm tính từ cuối thử nghiệm kiểm tra công hiệu (tính từ ngày tiêm miễn dịch trên động vật thí nghiệm).

Xem thêm: VẮC XIN QUAI BỊ (Vaccinum parotitidis vivum) – Dược điển Việt Nam 5

Đóng gói

Hộp 10 lọ tương đương 100 liều (mỗi lọ 5 ml chứa 10 liều). Lọ được đóng kín bằng nút cao su, ngoài nút cao su được đậy kín bởi một nắp nhôm.

Nhãn

Những thông tin đối với nhãn, hộp, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu của quy định hiện hành.