PHỤ LỤC 10.10

Hoạt lực của vitamin A được tính theo đơn vị quốc tế (ký hiệu IU). 1 IU vitamin A tương đương với 0,300 μg retinol; 0,344 μg retinyl aceuit; 0.359 μg retinyl propionat hoặc 0,550 μg retinyl palmitat.
Tiến hành định lượng nhanh nhất có thể trong điều kiện tránh ánh sáng, không khí và các chất oxy hóa, các chất xúc tác sự oxy hóa (như đồng, sắt), acid và tránh đun nóng (với vitamin A có nguồn gốc tự nhiên), tránh đun nóng kéo dài với retinol tổng hợp đậm đặc dạng bột và dạng dầu. Sử dụng các dung dịch mới pha.
Tùy theo đặc điểm của vitamin A trong các thuốc và nguyên liệu làm thuốc mà áp dụng 1 trong 5 phương pháp dưới đây để định lượng.

Phương pháp 1

(Phương pháp đo quang trực tiếp)
Có thể áp dụng đối với nguyên liệu là các ester của retinol đậm đặc dạng dầu với hàm lượng lớn (> 5000 lU/g). Cân chính xác đến 0,1 % (so với lượng cân) khoảng từ 25 mg đến 100 mg chế phẩm và đem hòa tan trong 5 ml pentan (TT), pha loãng bằng 2-propanol (TT) để được dung dịch chứa chính xác khoảng 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 ml.

Phương pháp 2

(Phương pháp đo quang sau khi chiết tách vitamin A)
Có thể áp dụng cho các nguyên liệu vitamin A có nguồn gốc tự nhiên và đa số các dạng thuốc chứa vitamin A:
Thuốc nang, viên nén, thuốc bột, thuốc mỡ, dầu gan cá… Lấy một lượng chế phẩm chứa khoảng 50 000 IU vitamin A vào bình nút mài, thêm 3 ml dung dịch kali hydroxyd (TT) 50 % mới pha, 30 ml ethanol (TT), đun sôi 30 min trên cách thủy có lắp ống sinh hàn hồi lưu, dưới dòng khí nitrogen không có oxygen. Làm nguội nhanh rồi dùng 30 ml nước cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn. Chiết 4 lần mỗi lần với 50 ml ether (TT) và bỏ lớp dưới khi tách
lớp hoàn toàn. Tập trung dịch chiết lại rồi rửa dịch chiết 4 lần, mỗi lần 50 ml nước cất, (chú ý lắc rất nhẹ nhàng ở 2 lần đầu để tránh tạo thành nhũ tương). Làm hay hơi dịch chiết ether trên cách thủy dưới dòng khí nitrogen không có oxygen hoặc cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 30 °C đến hết dung môi. Hòa tan cắn trong một lượng 2-propanol (TT) vừa đủ để thu được dung dịch chứa 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 ml. Đo độ hấp thụ của dung dịch thu được ở các bước sóng 300 nm, 310 nm, 325 nm, và 334 nm trong cốc dày 1 cm với mẫu trắng là 2-propanol (TT), sau đó xác định bước sóng có hấp thụ cực đại.

Chú ý
Trong cách tiến hành của phương pháp 2 nếu chế phẩm ở dạng thuốc nang, viên nén hoặc dạng bào chế thể rắn khác, sau khi đã bỏ vỏ, nghiền thành bột mà vẫn không xà phòng hóa dược (do ở dạng vi nang) thì phải xử lý trước bằng cách đun nóng với 10 ml nước cất trên cách thủy 5 min, dùng đũa thủy tinh nghiền nhỏ các chất rắn còn lại và giữ nóng 5 min nữa.
Khi tiến hành xà phòng hóa, nếu không có khí nitrogen có thể thay thế bằng cách cho chất chống oxy hóa vào bình phản ứng như 3 ml dung dịch hydroquinon 1 % trong ethanol, hoặc 30 mg BHT [butyl hydroxytoluen (TT)].
Để chiết vitamin A có thể thay ether (TT) bằng ether dầu hỏa (TT) hoặc n-hexan (TT).

Phương pháp 3

(Phương pháp sắc ký lỏng trực tiếp)
Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu vitamin A tổng hợp, các thành phẩm chứa vitamin A tổng hợp mà trong thành phần chỉ chứa vitamin A ở một dạng ester đồng nhất hoặc dạng retinol.

Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3).
Pha động: Methanol – ethyl acetat – nước (90 : 7 : 3).
Dung dịch thử: Lấy chính xác một lượng chế phẩm có chứa khoảng 4000 IU vitamin A cho vào bình định mức dung tích 100 ml, thêm ethanol (TT), lắc kỹ rồi thêm ethanol (TT) đến định mức, lắc đều. lọc.
Dung dịch chuẩn: Pha chất chuẩn vitamin A (dạng giống với dung dịch thử: retinol, retinyl acetat, retinyl palmitat…) trong ethanol (TT) để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ vitamin A chính xác khoảng 40 IU/ml.
Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (25 cm X 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm đến 10 μm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 325 nm.
Tốc độ dòng: 1,5 ml/min đến 2,0 ml/min.
Thể tích tiêm: 20 μl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống sắc ký: Tiến hành sắc ký với dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của 6 lần tiêm lặp lại mẫu chuẩn không được lớn hơn 2,0 %.
Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và dung dịch thử.
Cách tính kết quả:

Phương pháp 4

(Phương pháp sắc ký lỏng sau khi thủy phân)
Có thể áp dụng đối với nguyên liệu vitamin A tổng hợp dạng bột, dạng dầu và dạng nhũ tương.
Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3).

Pha động: Methanol – nước (95 : 5).
Dung dịch thử (1):
Đối với nguyên liệu dạng bột: Cân 0,200 g chế phẩm vào bình định mức 100 ml. Thêm khoảng 20 mg đến 30 mg bromelain (TT), 5,0 ml nước và 0,15 ml 2-propanol (TT). Đun trong cách thủy ở 60 °C đến 65 °C trong 5 min và thỉnh thoảng khuấy. Thêm 40 ml dung dịch tetrabutylamoni hydroxyd 0.1 M trong 2-propanol (TT). Khuấy nhẹ và để thủy phân trong cách thủy ở 60 °C đến 65 °C trong 10 min, thỉnh thoảng khuấy. Đảm bảo chế phẩm được làm ướt hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phòng rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng 2-propanol (TT) có chứa 0,1 % butylhydroxytoluen (TT). Lắc đều cẩn thận tránh tạo bọt khí. Dung dịch có thể vẩn đục.
Đối với nguyên liệu dạng dầu hoặc nhũ tương: Cân 0,100 g chế phẩm vào bình định mức 100 ml. Hòa tan ngay trong 5 ml pentan (TT). Thêm 40 ml dung dịch telrabutylamoni hydroxyd 0,1 N trong 2-propanol. Khuấy nhẹ và để thủy phân trong cách thủy ở 60 °C đến 65 °C trong 10 min, thỉnh thoảng khuấy nhẹ. Để nguội đến nhiệt độ phòng, rồi pha loãng thành 100,0 ml bằng 2-propanol (TT) có chứa 0,1 % butylhydroxytoluen (TT). Lắc cẩn thận
tránh tạo bọt khí.
Dung dịch thử (2): Pha loãng dung dịch thử (1) bằng 2-propanol (TT) để thu được dung dịch có nồng độ 100 IU/ml.
Lọc trước khi tiêm đối với dung dịch thử được chuẩn bị từ nguyên liệu dạng bột.
Dung dịch chuẩn (1): Cân chính xác 0,100 g retinyl acetat chuẩn (hàm lượng khoảng 1000000 IU/g) vào bình định mức 100 ml và tiến hành như dung dịch thử (1) đối với nguyên liệu dạng dầu hoặc nhũ tương.
Dung dịch chuẩn (2): Pha loãng 5,0 ml dung dịch chuẩn (1) thành 50,0 ml bằng 2-propanol (TT). Lắc cẩn thận tránh tạo bọt khí.
Điều kiện sẳc ký:
Cột kích thước (12,5 cm X 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 μm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 325 nm.
Tốc độ dòng: 1 ml/min.
Thể tích tiêm: 10 μl.
Cách tiến hành:
Tiến hành sắc ký dung dịch thử (2) và dung dịch chuẩn (2) với thời gian gấp 1,5 lần thời gian lưu của retinol.
Thời gian lưu của retinol khoảng 3 min.

Phương pháp 5

(Phương pháp sắc ký lỏng sau khi chiết tách vitamin A)
Có thể áp dụng đối với các chế phẩm phức tạp và có chứa vitamin A với hàm lượng thấp không thực hiện được 1 trong 4 phương pháp trên.
Phương pháp sắc ký lỏng (Phụ lục 5.3).
Pha động: Methanol – nước (97 : 3 ).
Dung dịch thử: Lấy một lượng chế phẩm chứa khoảng 2000 IU vitamin A vào bình cầu nút mài, thêm 5 ml dung dịch acid ascorbic (TT) 10 % mới pha và 10 ml dung dịch kali hydroxyd (TT) 80 % mới pha, 100 ml ethanol 96 % (TT), đun sôi 15 min trên cách thủy có lắp ống sinh hàn hồi lưu. thêm 100 ml dung dịch natri clorid (TT) 1 % và để nguội. Chuyển dung dịch vào bình chiết dung tích 500 ml, tráng rửa bình nút mài bằng 75 ml dung dịch natri clorid (TT) 1 % và rửa tiếp với 150 ml dung dịch đồng thể tích ether dầu hỏa (40 °C đến 60 °C) và ether (TT), chuyển hết dịch tráng rửa vào bình chiết ở trên. Lắc 1 min, khi tách lớp hoàn toàn, bỏ lớp dưới, rửa lớp trên lần đầu với 50 ml dung dịch kali hydroxyd (TT) 3 % trong dung dịch 10 % (tt/tt) ethanol 96 % (TT), sau đó rửa 3 lần, mỗi lần với 50 ml dung dịch natri clorid (TT) 1 %. Lọc nhanh lớp trên qua giấy lọc có chứa 5 g natri sulfat khan (TT) vào bình cầu 250 ml thích hợp để lắp vào dụng cụ cất quay. Rửa bình chiết bằng 10 ml hỗn hợp dung môi dùng để chiết mới pha [dung dịch đồng thể tích ether dầu hỏa (40 °C đến 60 °C) và ether (TT)], lọc và gộp các dịch lọc lại. Cất quay ở nhiệt độ không quá 30 °C dưới áp suất giảm (đuổi nước) và đóng đầy với khí nitrogen khi bay hơi xong. Hoặc có thể bay hơi dung môi dưới luồng khí nitrogen ở nhiệt độ không quá 30 °C. Hòa tan cắn trong 2-propanol (TT) và chuyển vào bình định mức 25 ml, pha loãng thành 25 ml với cùng dung môi, đun nóng nhẹ hay siêu âm nếu cắn.
Dung dịch chuẩn gốc: Hòa tan retinyl acetat chuẩn trong 2-propanol (TT) để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 1000 IU vitamin A trong 1 ml. Nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn gốc được xác định bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (Phụ lục 4.1). Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng 2-propanol (TT) tới nồng độ 10 đến 15 IU trong 1 ml rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 326 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng 2-propanol (TT) làm mẫu trắng.

Dung dịch chuẩn: Lấy chính xác 2 ml dung dịch chuẩn gốc đem xử lý hoàn toàn như mẫu thử. Xác định nồng độ chính xác của dung dịch chuẩn bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến (Phụ lục 4.1). Pha loãng dung dịch chuẩn bằng 2-propanol (TT) tới nồng độ 10 IU đến 15 IU trong 1 ml rồi đo độ hấp thụ ở bước sóng 325 nm trong cốc đo dày 1 cm, dùng 2-propanol (TT) làm mẫu trắng.

Điều kiện sắc ký:
Cột kích thước (25 cm X 4 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 đến 10 μm).
Tốc độ dòng: 1 ml/min.
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 325 nm.
Thể tích tiêm: 10 μl.
Cách tiến hành:
Tiến hành sắc ký 3 lần với mỗi dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Thời gian lưu của all-trans-retinol khoảng (5 ± 1) min.
Kết quả được chấp nhận nếu đáp ứng các yêu cầu sau:
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử có pic tương ứng với pic của all-trans-retinol trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn.
Khi dùng phương pháp thêm chuẩn vào dung dịch thử thì phần trăm thu hồi retinol acetat chuẩn phải lớn hơn 95 % và phần trăm thu hồi all-trans-retinol trong dung dịch chuẩn được xác định bằng phương pháp đo quang phải lớn hơn 95 % so với nồng độ tính từ dung dịch chuẩn gốc.
Tính kết quả:

ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN A
5 (100%) 1 vote

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here