VẮC XIN PHÒNG PAPILLOMAVIRUS Ở NGƯỜI (TÁI TỔ HỢP) (Vaccinum papillomaviri humani (ADNr)) – Dược điển Việt Nam 5

Vắc xin phòng papillomavirus ở người (HPV) là loại vắc xin được sản xuất từ các hạt giống như virus (virus-like particles, VLPs ) nhưng không gây nhiễm; có độ tinh khiết cao, chứa protein capsit chính (L1) của 1 hoặc nhiều typ HPV.
Các kháng nguyên HPV được điều chế theo công nghệ tái tổ hợp ADN. Tùy theo nhà sản xuất, VLPs tinh khiết có thể được hấp phụ vào tá chất dạng phối hợp nhôm hydroxyd và 3-0-desacyl-4′-monophosphoryl lipid A (MPL) hoặc nhôm hydroxyphosphat sulfat.

SẢN XUẤT

Vắc xin HPV được sản xuất bằng cách đưa gen mã hóa protein capsid của virus vào tế bào nấm men hoặc tế bào côn trùng/hệ thống vector biểu hiện Baculovirus rồi thu và tinh chế VLPs. Việc sản xuất vắc xin HPV dựa vào hệ thống ngân hàng tế bào và chủng giống gốc.
Vắc xin mẫu chuẩn: Vắc xin HPV chuẩn được lấy từ 1 lô vắc xin hoặc một trong các lô vắc xin đã được nghiên cứu lâm sàng và được khẳng định là có hiệu quả bảo vệ. Vắc xin mẫu chuẩn cần phải đạt yêu cầu về tính ổn định.

Xem thêm: HUYẾT THANH KHÁNG BẠCH HẦU (Immunoserum diphthericum) – Dược điển Việt Nam 5

Đánh giá đặc tính VLPs

Đặc tính của VLPs phải được đánh giá ngay trong quá trình sản xuất vắc xin. Các kỹ thuật thường dùng để đánh giá đặc tính của VLPs bao gồm xác định thành phần protein là kỹ thuật SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis), Western Blot, hấp phụ khối, phân tích trình tự amino acid. Hình thái và mức độ kết tập của các VLPs cũng được xác định để khẳng định các epitop có mặt trong vắc xin và là yếu tố cần thiết tạo hiệu quả cho vắc xin. Bên cạnh đó, các thành phần protein, lipid, acid nucleic và carbon hydrat cũng cần được xác định trong quá trình sản xuất vắc xin.

Ngân hàng tế bào và chủng giống gốc

Sản xuất vắc xin trên tế bào nấm men

Việc sử dụng bất kỳ dòng tế bào nào đều phải dựa vào hệ thông ngân hàng tế bào. Ngân hàng tế bào gốc và ngân hàng tế bào sản xuất phải đạt các yêu cầu về nhận dạng, độ tinh khiết, khả năng mọc và tính ổn định mới được đưa vào sản xuất. Đối với tế bào gốc và tế bào sản xuất, cần được đánh giá về tính đồng nhất gen. Đặc tính của tế bào chủ và vector biểu hiện can được mô tả rõ. Các phương pháp vật lý được sử dụng trong quá trình sản xuất nhằm kích thích và kiểm soát sự biểu hiện của gen từ tế bào vật chủ. Các đặc tính của chúng sản xuất tái tổ hợp (tế bào vật chủ phối hợp với hệ thống vector biểu hiện) phải được mô tả đầy đủ, chứng minh không có các yếu tố tự sinh và thông tin về tính đồng nhất gen của các ngân hàng tế bào sản xuất và ngân hàng tế bào gốc. Cần mô tả đầy đủ các đặc tính sinh học của tế bào chủ và các vector biểu hiện.

Sản xuất vắc xin trên tế bào côn trùng/hệ thống vector biểu hiện Bacalovirus

Trên tế bào côn trùng: Ngân hàng tế bào phải đạt yêu cầu về nhận dạng, độ tinh khiết, khả năng mọc, tính ổn định, các yếu tố ngoại lai thì mới được đưa vào sản xuất. Các đặc tính này có thể được đánh giá ở các giai đoạn phù hợp trong quá trình sản xuất. Nếu các tế bào côn trùng được sử dụng để sản xuất VLPs thì việc dùng tế bào côn trùng phải dựa vào một hệ thống ngân hàng tế bào gốc. Ngoài ra, tế bào gốc, tế bào sản xuất nếu nhân lên ở số lần tới hoặc vượt quá giới hạn cho phép thì phải được kiểm tra về tính sinh khối u trên một hệ thống thử nghiệm trên động vật và kiểm tra sự có mặt của các Retrovirus và các virus khác trên động vật chân đốt.
Baculovirus tái tổ hợp: Việc sử dụng vector Baculovirus tái tổ hợp là dựa vào hệ thống chủng giống gốc với số lần cấy chuyển xác định từ chủng virus ban đau thành chủng gốc và chủng sản xuất. Vector biểu hiện Baculovirus tái tổ hợp chứa chuỗi mã hóa của kháng nguyên L1 của HPV. Sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử kết hợp với một số thử nghiệm khác để xác định các phân đoạn của cấu trúc biểu hiện trong protein tái tổ hợp tinh chế và khẳng định chất lượng cũng như tính ổn định của kháng nguyên L1. Baculovirus tái tổ hợp phải được theo dõi trong quá trình sản xuất vắc xin bao gồm các thông tin như nguồn gốc gen, nhận dạng, cấu trúc, cấu tạo và đặc tính gen. Chủng gốc Baculovirus tái tổ hợp được sản xuất với so lượng lớn và được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ phù hợp.
Chỉ những chủng giống gốc nào đạt yêu cầu các thử nghiệm dưới đây mới được sử dụng để nhân giống.

Nhận dạng

Nhận dạng chủng gốc và chủng làm việc bằng cách sử dụng một kỹ thuật phù hợp, ví dụ kỹ thuật khuếch đại gen.

Nồng độ virus

Nồng độ virus trong chủng virus gốc và chủng sản xuất phải đảm bảo tính đồng nhất trong quá trình sản xuất.

Các yếu tố ngoại lai

Chủng virus làm việc cũng phải tuân thủ các tiêu chuẩn như chủng virus giống gốc và tế bào chứng. Các yếu tố ngoại lai cần chú ý là Spiroplasma và virus sinh sản trên côn trùng đặc biệt là những vins sinh sản trên côn trùng có khả năng gây bệnh cho người (ví dụ: Arbovirus).

Vô khuẩn

Chủng Baculovirus tái tổ hợp phải được kiểm tra xem có bị nhiễm vi khuẩn, nấm và Mycoplasma bằng thử nghiệm thích hợp (Phụ lục 15.7).

Mycobacteria

Chủng Baculovirus tái tổ hợp sẽ phải được kiểm tra về Mycobacterium spp.

Kiểm tra các tế bào chứng dùng cho sản xuất chủng

Xem phần kiểm tả tế bào chứng dưới đây.

Nhân giống virus và thu hoạch

Quá trình nuôi cấy tế bào và chủng Baculovirus giống gốc đều phải được thực hiện trong điều kiện vô khuẩn hoàn toàn và không có bất cứ loại tế bào nào khác đang được nuôi cấy.
Tại khu vực dành cho sản xuất nuôi cấy tế bào hệ thống biểu hiện Baculovirus, virus được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy trung gian và được kiểm tra nghiêm ngặt 5 thử nghiệm dưới đây:

Nhận dạng

Nhận dạng virus bằng cách nhận dạng typ HPV và sử dụng thử nghiệm miễn dịch với các kháng thể đặc hiệu hoặc các kỹ thuật sinh học phân tử như kỹ thuật khuếch đại gen.

Vô khuẩn

Mỗi môi trường nuôi cấy trung gian có chứa virus đều phải được kiểm tra và đạt yêu cầu về vô khuẩn. Kiểm tra với 10 ml cho mỗi môi trường (Phụ lục15.7).

Nồng độ virus

Nồng độ virus trong mỗi môi trường nuôi cấy trung gian có chứa virus được xác định bằng các thử nghiệm phù hợp như thử nghiệm tạo đám quầng hoặc khuếch đại gen, mục đích để đảm bảo tính đồng nhất trong quá trình sản xuất.

Các yếu tố ngoại lai

Tất cả các môi trường nuôi cấy trung gian có chứa virus đều phải đảm bảo đạt yêu cầu khi kiểm tra về yếu tố ngoại lai.

Tế bào chứng

Tế bào chứng được lấy ra từ các môi trường nuôi cấy trung gian chứa virus đều phải đạt yêu cầu khi tiến hành thử nghiệm nhận dạng và kiểm tra các yếu tố ngoại lai.

Mẻ gặt đơn

Một mẻ gặt đơn phải đạt các yêu cầu sau đây mới được sử dụng để tiến hành sản xuất kháng nguyên đơn giá tinh chế.

Nhận dạng

Mỗi mẻ gặt đơn phải được tiến hành thử nghiệm nhận dạng typ HPV, sử dụng thử nghiệm miễn dịch hoặc sinh học phân tử như PCR hoặc lai. Thử nghiệm nhận dạng có thể thay thế bằng một phần của thử nghiệm kiểm tra độ tinh khiết của kháng nguyên.

Vô khuẩn

Mỗi mẻ gặt đơn đều phải được kiểm tra và đáp ứng yêu cầu về tính vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Các yếu tố ngoại lai

Tất cả các mẻ gặt đơn đều phải được kiểm tra về các yếu tố ngoại lai trong suốt quá trình cấy tế bào sản xuất hệ thống biểu hiện Baculovirus. Như đã đề cập ở trên, cần đặc biệt chú ý đến những virus sinh sản trên côn trùng trong các ngân hàng tế bào và chủng virus giống gốc có khả năng gây bệnh cho người (ví dụ: Arbovirus).

Tế bào chứng

Trong quá trình cấy tế bào/sản xuất hệ thống biểu hiện Baculovirus, tế bào chứng phải đạt yêu cầu về nhận dạng và yếu tố ngoại lai. Cần đặc biệt chú ý đến những virus sinh sản trên côn trùng trong các ngân hàng tế bào và trong chủng virus giống gốc có khả năng gây bệnh cho người.

Kháng nguyên đơn giá tinh chế

Chỉ các kháng nguyên đơn giá tinh chế đạt yêu cầu mới được đưa vào sản xuất vắc xin bán thành phẩm cuối cùng. Các thử nghiệm dưới đây có thể không yêu cầu nếu đã được thực hiện ở giai đoạn kháng nguyên đơn giá hấp phụ.

Protein toàn phần

Hàm lượng protein toàn phần được xác định bằng một phương pháp thử nghiệm phù hợp đã được thẩm định. Hàm lượng protein phải nằm trong tiêu chuẩn đăng ký đã được phê duyệt.

Hàm lượng kháng nguyên và nhận dạng

Hàm lượng và tính đặc hiệu của mỗi typ kháng nguyên HPV được xác định bằng phương pháp hóa miễn dịch phù hợp như thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn men (ELISA). Nên sử dụng kháng thể đơn dòng kháng trực tiếp với các epitop kháng nguyên hoặc kỹ thuật khuếch tán đơn. Tỷ lệ kháng nguyên/protein phải đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn cho phép đã được phê duyệt.

Độ tinh khiết kháng nguyên

Độ tinh khiết của kháng nguyên đơn giá tinh khiết được xác định bằng các phương pháp phù hợp như kỹ thuật SDS-PAGE, giới hạn xác định là 1 % các tạp chất hoặc tốt hơn so với tổng protein. Một chế phẩm chuẩn sẽ được sử dụng để đánh giá mỗi phép thử. Độ tinh khiết của protein được tính bằng tỷ lệ giữa protein L1 với tổng protein và đơn vị tính theo phần trăm. Các typ trong vắc xin HPV phải đạt yêu cầu về độ tinh khiết kháng nguyên theo tiêu chuẩn được phê duyệt.

Tỷ lệ monomer L1

Thử nghiệm đánh giá độ tinh khiết của kháng nguyên cũng có mục đích đánh giá tính toàn vẹn của các monomer L1. Tỷ lệ monomer L1 là tỷ lệ giữa monomer L1 nguyên vẹn / tổng protein. Tỷ lệ này được tính theo phần trăm.

Cấu trúc và kích cỡ của VLP

Cấu trúc và kích cỡ của các VLP được xác định và theo dõi bằng phương pháp phù hợp như phương pháp phân bố ánh sáng động (dynamic light scattering). Kích cỡ của VLP phải nằm trong giới hạn cho phép đã được phê duyệt.

Thành phần

Hàm lượng các thành phần protein, lipid, acid nucleic và carbon hydrat cũng cần được xác định ở các công đoạn phù hợp.

ADN tồn dư

Không được quá 10 ng ADN tồn dư trong kháng nguyên tinh khiết tính trên mỗi liều đơn dùng cho người, được xác định bằng các phương pháp có độ nhạy cao.

Protein tế bào chủ tồn dư

Hàm lượng protein tế bào chủ tồn dư được xác định bằng các thử nghiệm phù hợp. Kết quả phải nằm trong giới hạn cho phép đã được phê duyệt.
Các hóa chất sử dụng trong quá trình phá vỡ tế bào và tinh chế
Các hóa chất sử dụng trong quá trình tinh chế và các giai đoạn khác của quá trình sản xuất được xác định bằng các thử nghiệm phù hợp. Hàm lượng của các hóa chất này phải nằm trong giới hạn cho phép được phê duyệt.

Albumin

Nếu huyết thanh động vật được dùng trong nuôi cấy tế bào côn trùng hoặc tế bào động vật có vú để sản xuất vắc xin thì hàm lượng albumin tồn dư phải được xác định.

Vô khuẩn

Mỗi kháng nguyên đơn giá tinh khiết đều phải được kiểm tra và đáp ứng yêu cầu vô khuẩn. Kiểm tra với 10 ml cho mỗi mẫu (Phụ lục 15.7).

Kháng nguyên đớn giá hấp phụ

Các kháng nguyên đơn giá tinh khiết được hấp phụ vào một chất hấp phụ phù hợp như muối nhôm. Chỉ những kháng nguyên đơn giá hấp phụ đạt yêu cầu các thử nghiệm dưới đây mới được sử dụng để sản xuất vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Vô khuẩn

Mỗi kháng nguyên đơn giá hấp phụ đều phải được kiểm tra và đáp ứng yêu cầu vô khuẩn. Kiểm tra với 10 ml cho mỗi mẫu (Phụ lục15.7).

Nội độc tố vi khuẩn

Mỗi kháng nguyên đơn giá hấp phụ đều phải được kiểm tra hàm lượng nội độc tố vi khuẩn (Phụ lục 13.2). Kết quả kiểm tra phải nằm trong giới hạn cho phép đã được phê duyệt.

Hàm lượng kháng nguyên và nhận dạng

Mỗi typ kháng nguyên HPV được nhận dạng bằng các phương pháp hóa miễn dịch phù hợp như thử nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA), kỹ thuật ELISA. Nên sử dụng kháng thể đơn dòng kháng trực tiếp với epitop kháng nguyên. Tỷ lệ kháng nguyên protein phải đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn đã đăng ký của nhà sản xuất.

Nồng độ chất hấp phụ

Mỗi mẫu kháng nguyên đơn giá phải được kiểm tra và xác định nồng độ chất hấp phụ. Nồng độ chất hấp phụ phải nằm trong khoảng cho phép đã được phê duyệt.

KIỂM ĐỊNH VẮC XIN BÁN THÀNH PHẨM CUỐI CÙNG

Vắc xin bản thành phẩm cuối cùng được sản xuất từ các kháng nguyên HPV đơn giá tinh khiết hoặc kháng nguyên HPV đơn giá hấp phụ. Chất bảo quản kháng khuẩn và tá chất dạng phối hợp nhôm hydroxyd và 3-0-desacyl-4-monophosphoryl lipid A (MPL) hoặc nhôm hydroxyphosphat sulfat có thể được thêm vào. Chỉ có những mẫu vắc xin bán thành phẩm cuối cùng đạt yêu cầu các thử nghiệm dưới đây mới được sử dụng để sản xuất vắc xin thành phẩm.

Chất bảo quản kháng khuẩn

Hàm lượng chất bảo quản kháng khuẩn trong vắc xin bán thành phẩm cuối cùng được xác định bằng các phương pháp phù hợp. Tổng hàm lượng chất bảo quản cho phép phải từ 85 % đến 115 % hàm lượng chất bảo quản đã đăng ký của nhà sản xuất.

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu về vô khuẩn. Kiểm tra với 10 ml cho mỗi mẫu (Phụ lục 15.7).

Chất hấp phụ

Nếu thành phần nhôm được sử dụng là chất hấp phụ thì hàm lượng nhôm phải nằm trong giới hạn cho phép đối với từng loại vắc xin (Phụ lục 15.27).

Mức độ hấp phụ

Mức độ hấp phụ (khả năng hấp phụ hoàn toàn) của kháng nguyên trong vắc xin bán thành phẩm cuối cùng phải được đánh giá. Tuy nhiên, có thể bỏ qua thử nghiệm này nếu chứng minh được tính ổn định của quy trình hoặc nếu đã tiến hành đánh giá ở vắc xin thành phẩm.

Công hiệu (Có thể tiến hành công hiệu in vitro hoặc công hiệu in vivo)

Công hiệu vắc xin HPV được tiến hành song song với vắc xin mẫu chuẩn và chứng (internal control). Có thể dùng phương pháp gây miễn dịch trên chuột để xác định hiệu giá kháng thể thu được (công hiệu in vivo) hoặc phương pháp sử dụng kháng thể đặc hiệu thực hiện trong phòng thí nghiệm để định lượng trực tiếp hàm lượng kháng nguyên có trong vắc xin (công hiệu in vitro).

KIỂM ĐỊNH VẮC XIN THÀNH PHẨM

Chỉ những vắc xin thành phẩm đạt yêu cầu các thử nghiệm dưới đây mới được sử dụng trên người. Thử nghiệm xác định hàm lượng chất bảo quản có thể không yêu cầu nếu đã thực hiện và đạt yêu cầu đối với vắc xin bán thành phẩm cuối cùng. Bên cạnh đó, thử nghiệm công hiệu trên động vật thi nghiệm (in vivo) cũng có thể không yêu cầu nếu đã thực hiện và đạt yêu cầu đối với vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Thể tích đơn vị phân liều và cảm quan

Thể tích: Kiểm tra ít nhất 3 đơn vị đóng ống về thể tích và độ kín, khít. Mỗi đơn vị đóng ống vắc xin phải đảm bảo có thể tích không được thấp hơn thể tích ghi trên nhãn và trong hồ sơ đăng ký; đảm bảo độ kín, khít
Cảm quan: Vắc xin phải không có vật thể lạ, có hình thái và màu sắc như đã đăng ký. Quan sát bằng mắt thường về dạng sản phẩm và màu sắc.

Nhận dạng

Các typ HPV khác nhau trong vắc xin được nhận dạng bằng các thử nghiệm hóa miễn dịch phù hợp (thường bằng phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đặc hiệu hoặc bằng thử nghiệm in vivo). Thử nghiệm công hiệu có thể bao gồm cả thử nghiệm nhận dạng.

Vô khuẩn

Đáp ứng yêu cầu về tính vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

pH

Phải nằm trong giới hạn cho phép (Phụ lục 15.33).

Chất bảo quản kháng khuẩn

Xác định hàm lượng chất bảo quản trong vắc xin thành phẩm bằng các phương pháp hóa học hoặc hóa lý phù hợp. Hàm lượng chất bảo quản không được nhỏ hơn hàm lượng tối thiểu có tác dụng bảo quản và không được lớn hơn 115 % hàm lượng ghi trên nhãn.

Chất gây sốt (Phụ lục 15.12)

Mỗi lô vắc xin thành phẩm đều phải được kiểm tra chất gây sốt trên thỏ. Có thể tiến hành cả thử nghiệm kiểm tra nội độc tố nếu có điều kiện thích hợp.
Riêng vắc xin có sử dụng tá chất là MPL thì thử nghiệm chất gây sốt nên được kiểm tra. Thử nghiệm chất gây sốt được tiến hành cho đến khi chứng minh được tính an toàn
và ổn định của sản xuất.

Nội độc tố vi khuẩn (Phụ lục 13.2)

Không được quá 5 EU/liều đơn dùng cho người. Những chế phẩm có chứa chất kích thích miễn dịch (như MPL) thường gây nhiễu thử nghiệm, vì vậy phải kiểm tra chất gây sốt trên thỏ đối với các sản phẩm này.

Chất hấp phụ (Phụ lục 15.27)

Nếu vắc xin có chứa chất hấp phụ, hàm lượng chất hấp phụ phải nằm trong giới hạn cho phép đã được phê duyệt.

Mức độ hấp phụ

Mức độ hấp phụ của mỗi kháng nguyên cũng được đánh giá. Thử nghiệm này có thể không phải tiến hành trong kiểm định xuất xưởng thông thường nếu đã chứng minh được tính ổn định của sản phẩm.

Tá chất (nếu sử dụng MPL)

Xác định bằng phương pháp sắc ký khí.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Từ 30 µg/liều đến 50 µg/liều.

An toàn chung

Mỗi lô vắc xin thành phẩm phải được kiểm tra về độc tính không mong muốn (có thể được gọi là độc tính không đặc hiệu) bằng thử nghiệm an toàn chung (Phụ lục 15.11). Thử nghiệm này có thể không phải thực hiện trong kiểm định xuất xưởng thông thường nếu công hiệu của vắc xin được tiến hành theo phương pháp in vivo.

Công hiệu in vitro

Công hiệu in vitro của vắc xin phòng HPV được xác định bằng kỹ thuật ELISA, theo phương pháp “sandwich” hai giai đoạn. Các kháng nguyên VLP (L1) kết hợp với kháng thể IgG kháng HPV đa dòng thỏ (hoặc các loại kháng thể đặc hiệu typ HPV khác) đã được gắn trên các phiến nhựa (kháng thể 1). Phức hợp kháng nguyên – kháng thể 1 tiếp tục được gắn kháng thể chuột, đặc hiệu VLP (kháng thể 2) và cộng hợp. Chất hiện màu được gắn với phức hợp kháng thế 1 – kháng nguyên – kháng thể 2. Hàm lượng kháng nguyên được tính toán dựa trên mật độ màu của giếng chứa các mẫu vắc xin.
Phản ứng ELISA được thực hiện với phần nước nổi sau khi đã ly tâm của vắc xin để có được các kháng nguyên không hấp phụ. Quy trình thực hiện công hiệu in vitro của mỗi typ kháng nguyên HPV tương tự nhau và được thực hiện riêng rẻ.

Thử nghiệm công hiệu và nhận dạng đối với vắc xin Cervarix:

Vật liệu:
Phiến nhựa mới, 96 giếng
Vắc xin phòng HPV

HPV 16 và 18 chuẩn
HPV 16 và 18 mẫu chứng
Kháng thể thỏ đa dòng kháng HPV 16 và 18 (kháng thể 1).

Kháng thể chuột đơn dòng kháng HPV 16 và 18 (kháng thể 2, “sơ cấp”).
Cộng hợp kháng thể kháng chuột – Biotin (kháng thể 3),

Phức hợp Streptavidin-biotin-peroxidase.
Tiến hành:
Chuẩn bị phiến: Phiến trắng miễn dịch 96 giếng được gắn kháng thể thỏ đa dòng kháng HPV pha loãng trong dung dịch PBS, ủ phiến 4 °C qua đêm, rửa và được làm bão hòa bằng dung dịch PBS-casein ở 37 °C/1h.
Kiểm định mẫu vắc xin: Vắc xin mẫu chuẩn, vắc xin mẫu thử và mẫu chứng được ly tâm với tốc độ 13.000 r/min trong 10 min để tách toàn bộ phần nước nổi. Pha loãng bậc 2 phần nước nổi ở các mẫu vắc xin sao cho nồng độ kháng nguyên ở các mẫu vắc xin sao cho nồng độ kháng nguyên ở các độ pha thấp nhất đạt khoảng 250 ng/mL đối với HPV-16 và 2000 ng/mL đối với HPV-18.
Rồi pha tiếp bậc 2 ra từ 20 đến 2-10 để làm thử nghiệm công hiệu. Thử nghiệm nhận dạng chỉ cần 1 độ pha là 2°. Các mẫu vắc xin đã pha loãng được nhỏ vào các giếng phiến, 3 giếng cho mỗi độ pha, ủ 37 °C/2 h, lắc nhẹ. Rửa phiến rồi nhỏ kháng thể chuột đơn dòng kháng HPV vào tất cả các giếng sau khi đã rửa sạch, ủ 37 °C/1 h. Rửa phiến rồi nhỏ dung dịch cộng hợp kháng thể kháng chuột – Biotin và ủ 37°C/1h. Rửa và nhỏ phức hợp chất hiện màu Streptavidin biotin-peroxidase, ù 37 °C/30 min. Rửa phiến rồi nhỏ dung dịch chất hiện màu TMB, ủ 15 min ở nhiệt độ phòng tránh ánh sáng. Nhỏ dung dịch dừng phản ứng. Đo mật độ quang học với bước sóng 450/620 nm.
Tiêu chuẩn cho thử nghiệm nhận dạng:
Thử nghiệm có giá trị khi OD của các giếng trống nhỏ hơn 0,2 (< 0,2).
Kháng nguyên HPV trong mẫu thử nghiệm được coi là dương tính khi giá trị trung bình OD mẫu thử lớn hơn OD tương ứng với đường tiệm cận dưới của mẫu chuẩn.
Thử nghiệm công hiệu:
Tính kết quả theo phần mềm Excel. Hệ số tương quan (R² ) của mẫu chuẩn phải lớn hơn 95 %.
Hàm lượng kháng nguyên của từng typ trong mẫu thử được tính từ ít nhất 3 độ pha liên tiếp trong số 10 độ pha loãng dùng trong phản ứng.
Tiêu chuẩn cho thử nghiệm công hiệu:
Typ 16 Công hiệu tương quan của vắc xin mẫu thử và vắc xin mẫu chứng phải từ 0,78 đến 1,45.
Typ 18: Công hiệu tương quan của vắc xin mẫu thử và vắc xin mẫu chứng phải từ 0,79 đến 1,47.

Thử nghiệm định lượng và nhận dạng kháng nguyên đối với vắc xin Gardasil

Vật liệu:
Phiến nhựa mới, 96 giếng
Vắc xin tứ giá phòng HPV
Kháng thể bắt giữ (capture antibody)
Kháng thể đơn dòng đặc hiệu typ HPV-6, 11, 16, 18.

Kháng thể đơn dòng chuột – Goat anti-mouse IgG_2b -HRP antibody.
Kháng thể cộng hợp – Horseradish peroxidase (HPR- conjugated antibody).
Tetramethylbenzidin (TMB).
Tiến hành
Chuẩn bị phiến thử nghiệm: Phiến miễn dịch trắng. 96 giếng được gắn bản bằng kháng thể đơn dòng kháng HPV đặc hiệu, pha loãng trong dung dịch PBS. Phiến gắn bản được ủ qua đêm ở nhiệt độ từ 2 °C đến 8 °C và được cố định bằng dung dịch PBS có 1 % BSA, 0,05 % Tween 20. Để ở nhiệt độ từ 22 °C đến 28 °C trong 1 h đến 6 h. Kiểm định mẫu vắc xin: Vắc xin mẫu chuẩn, vắc xin mẫu thử được ly tâm với tốc độ 650 r/min trong 10 min để tách lấy phần nước nổi. Pha loãng nước nổi bằng dung dịch PBS có 1 % BSA và 0,05 % Tween 20 trong các phiến trắng riêng rẽ với các độ pha loãng bậc 2, sao cho nồng độ kháng nguyên của các typ HPV đạt khoảng 2 ug/mL. Pha tiếp bậc 3 từ 3° đến 3-10 để làm thử nghiệm công hiệu. Thử nghiệm nhận dạng chỉ cần 1 độ pha là 3°. Toàn bộ các mẫu vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử nghiệm với các độ pha loãng ở trên được chuyển tương ứng sang phiến đã gắn bản bằng kháng thể trước đó. Dung dịch đệm citrat được thêm vào các giếng ngay sau đó để một lần nữa loại trừ chất hấp phụ trong vắc xin, ủ các phiến ở nhiệt độ từ 22 °C đến 28 °C qua đêm và lắc nhẹ. Sau đó rửa phiến rồi nhỏ kháng thể đơn dòng chuột vào tất cả các giếng. Ủ 1 h ở nhiệt độ từ 22 °C đến 28 °C. Rửa phiến rồi nhỏ kháng thể cộng hợp, ủ 1 h ở nhiệt độ từ 22 °C đến 28 °C. Rửa rồi nhỏ chất hiện màu là dung dịch TMB không pha loãng. Để 5 min rồi nhỏ dung địch dừng phản ứng. Đo mật độ quang với bước sóng 450 nm.
Tính kết quả theo chương trình SoftMax Pro hoặc phần mềm Excel.
Tiêu chuẩn chấp thuận:
Hàm lượng của mỗi typ phải nằm trong giới hạn nhà sản xuất đăng ký đã được phê duyệt.
Hàm lượng HPV tổng số phải không được lớn hơn 500 IU/ml (≤ 500 IU/ml).

Công hiệu in vivo (Yêu cầu đối với vắc xin thị giá)

Động vật thí nghiệm:

Chuột nhắt trắng giống BALB/C hoặc các giống chuột khác đã được thẩm định, khoẻ mạnh và từ cùng một đàn, khoảng 6 tuần đến 8 tuần tuổi, tốt nhất là chuột cùng một giới.
Chuẩn bị vắc xin thử nghiệm:
Vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử được pha loãng bậc 2 thành 5 độ pha sao cho nồng độ kháng nguyên của mẫu pha loãng cuối cùng đạt khoảng 0,56 ug/0,5 ml. Dung dịch để pha vắc xin là nước muối sinh lý. Tiêm màng bụng 0,5 ml mỗi độ pha loãng vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu cần kiểm tra cho mỗi chuột. Mỗi độ pha loãng vắc xin tiêm ít nhất 10 chuột. Tất cả các chuột sau gây miễn dịch được nuôi từ 21 ngày đến 22 ngày trong điều kiện như nhau. Tiến hành gây mê và lấy máu tim chuột. Các mẫu máu được ly tâm 3000 r/min trong 10 min ở nhiệt độ 4 °C đến 8 °C, tách huyết thanh. Các mẫu huyết thanh được bảo quân ở nhiệt độ âm 20 °C (-20 °C). Xác định hiệu giá kháng thể kháng HPV bằng kỹ thuật ELISA trên bộ sinh phẩm chẩn đoán đặc hiệu. Kết quả được tính theo chương trình Probit Analysis (WHO).
Thử nghiệm có giá trị khi:
ED₅₀ của vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử đều nằm trong khoảng giữa liều tiêm lớn nhất và nhỏ nhất.
Phân tích thống kê cho thấy đạt yêu cầu về tuyến tính và song song.
Giới hạn tin cậy (P=0,95) nằm trong giới hạn cho phép.

Tiêu chuẩn chấp thuận
Công hiệu tương quan không được nhỏ hơn 0,5 (≥ 0,5).

Đóng gói

Vắc xin phòng HPV được đóng trong lọ thủy tinh trung tính hoặc bơm tiêm đóng sẵn (thủy tinh loại I) với pít tông có đáy bằng cao su (cao su butyl), có hoặc không có kim tiêm. Mỗi lọ/bơm tiêm chứa I liều đơn 0,5 ml huyền dịch. Hộp carton có thể chứa một hoặc nhiều lọ/bơm tiêm đơn liều tùy theo từng nhà sản xuất.

Bảo quản

Vắc xin phòng HPV phải được bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, tuyệt đối không được làm vắc xin đông băng. Giữ nguyên trong hộp để tránh ánh sáng.

Xem thêm: GLOBULIN MIỄN DỊCH NGƯỜI (Immunoglobulinum humanum normale) – Dược điển Việt Nam 5

Nhãn

Thông tin trên vỏ hộp, nhãn lọ, tờ hướng dẫn sử dụng phải đáp ứng những yêu cầu theo quy định hiện hành.

Cách dùng, liều dùng

Đường dùng: Tiêm bắp vào vùng cơ delta.
Liều dùng, lịch tiêm: Theo hướng dẫn cụ thể đã đăng ký của nhà sản xuất.