VẮC XIN QUAI BỊ (Vaccinum parotitidis vivum) – Dược điển Việt Nam 5

Vắc xin quai bị là chế phẩm chứa virus quai bị sống, giảm độc lực, dạng động khô; được sản xuất từ các virus phát triển trên dòng tế bào thích hợp.
Hoàn nguyên vắc xin ngay trước khi sử dụng bằng nước hồi chỉnh như đã ghi trên nhãn, được dung dịch trong, có thể có màu nếu có chất chỉ thị pH.
Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu dưới đây:

Sản xuất

Chủng sản xuất

Sản xuất được dựa trên hệ thống chủng gốc (master seed) virus giảm độc lực, được phê duyệt bởi Cơ quan Kiểm định Quốc gia. Chủng virus quai bị dùng để sản xuất vắc xin phải có hồ sơ ghi chép lịch sử chủng, bao gồm những thông tin về chủng gốc và các đời nhân lên tiếp theo của chủng này. Chủng sản xuất được bảo quản ở dạng đông khô trong điều kiện nhiệt độ dưới -20 °C; nếu không đông khô phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới -60 °C và được giám sát chặt chẽ nhiệt độ trong quá trình bảo quản. Chúng sản xuất phải tuân thủ các điều kiện dưới đây
Nhận dạng:
Các lô chủng gốc và chủng sản xuất phải được nhận dạng bằng phương pháp trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu quai bị trên nuôi cấy tế bào hoặc nhấn dạng bằng phương pháp RT-PCR.
Hàm lượng virus:
Hàm lượng virus của các lô chủng gốc và chủng sản xuất phải được kiểm tra để đảm bảo tính ổn định của sản xuất.

Các yếu tố ngoại lai:

Lô chủng sản xuất phải tuân thủ các yêu cầu đối với các lô chủng sản xuất vắc xin, không được có các yếu tố ngoại lai.
Độc lực:
Lô chủng sản xuất phải tuân thủ yêu cầu về thử nghiệm độc lực của các vắc xin sống. Khi Macaca và Cercopithecus phù hợp với thử nghiệm này.

Xem thêm: HUYẾT THANH MIỄN DỊCH DÙNG CHO NGƯỜI (Immunosera ad usunt humanum)- Dược điển Việt Nam 5

Tế bào sản xuất

Sử dụng ngân hàng tế bào sản xuất hoặc từ tế bào phôi có nguồn gốc từ trứng không có tác nhân gây bệnh (SPF) và được cơ quan kiểm định quốc gia phê chuẩn.
Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy tế bào:

Huyết thanh dùng để nhân tế bào dùng cho sản xuất vắc xin quai bị phải được kiểm tra và chứng minh là đạt yêu cầu vô khuẩn (không có vi khuẩn, nấm và Mycoplasma và chứng minh không có chứa virus). Huyết thanh người không được sử dụng trong tất cả các môi trường nuôi cấy của quá trình sản xuất vắc xin.

Quy trình sản xuất và kiểm định sản xuất

Chủng virus quai bị được phát triển trên tế bào phôi hoặc tế bào từ ngân hàng tế bào sử dụng môi trường thích hợp. Hỗn dịch virus được gặt, hộn, bổ sung chất bảo quản, lọc, pha loãng, đóng lọ và đông khô theo quy trình đã được phê chuẩn. Trong quá trình sản xuất, tất cả các khâu đều được kiểm tra từ nguyên liệu nguồn (trứng, môi trường sử dụng cho sản xuất, huyết thanh bảo thai bé, trypsin tách tế bào….); tế bào sử dụng cho sản xuất, mẻ gặt đơn, loạt hỗn dịch virus hộn, vắc xin bán thành phẩm trung gian, vắc xin bán thành phẩm cuối cùng, vắc xin thành phẩm được kiểm tra tác nhân ngoại lai, kiểm tra hiệu giá virus, kiểm tra tính vô khuẩn…
Tất cả quá trình sản xuất ngân hàng tế bào và các nuôi cấy tế bào tiếp theo sau đó phục vụ cho quá trình sản xuất vắc xin quai bị đều phải được tiến hành trong các điều kiện vô trùng, trong khu vực không lưu giữ các dòng tế bào khác. Huyết thanh động vật có thể được sử dụng trong môi trường nuôi cấy của quá trình sản xuất. Huyết thanh và trypsin dùng để pha chế huyền dịch tế bào và pha môi trường nuôi cấy sẽ phải cho thấy không chứa các yếu tố ngoại lai. Môi trường nuôi cấy tế bào có thể chứa một chỉ thị pH như đỏ phenol và lượng kháng sinh nhỏ nhất có tác dụng.

Kiểm định mẻ gặt đơn

Mỗi mẻ gặt đơn phải đạt các tiêu chuẩn dưới đây mới được sử dụng để pha chế vắc xin bán thành phẩm cuối cùng

Nhận dạng: Mẻ gặt đơn chứa virus quai bị phải được nhận dạng virus bằng phương pháp trung hòa hoặc bằng phương pháp RT-PCR.
Nồng độ virus: Nồng độ virus trong mỗi mẻ gặt đơn phải được xác định để giám sát tính ổn định của sản xuất và từ đó xác định độ pha được dùng cho vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Các yếu tố ngoại lai: Mỗi mẻ gặt đơn đều phải kiểm tra để xác định không chứa các yếu tố ngoại lai.
Kiểm tra tế bào và trứng: Nếu sử dụng tế bào lưỡng bội người cho sản xuất, phải kiểm tra để nhận dạng chúng; các tế bào chứng và trứng chứng phải được kiểm tra để xác định không chứa các yếu tố ngoại lai.
Vắc xin quai bị sống giảm độc lực có thể được điều chế với chất ổn định thích hợp và đông khô ở dạng vắc xin đơn hoặc phối hợp với vắc xin sởi và rubella sống giảm độc lực.

Kiểm định vắc xin bán thành phẩm cuối cùng

Các mẻ gặt đơn vắc xin đạt các yêu cầu nêu trên sẽ được hộn lại và lọc để loại bỏ tế bào. Thêm chất ổn định thích hợp và được pha thành độ pha loãng thích hợp.
Mỗi lô vắc xin bán thành phẩm cuối cùng sẽ phải đạt yêu cầu dưới đây mới được tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo để sản xuất vắc xin thành phẩm:

Vô khuẩn

Vắc xin bán thành phẩm cuối cùng phải được kiểm tra tính vô khuẩn trên môi trường thích hợp, không có vi khuẩn, nấm và Mycoplasma.

Kiểm định vắc xin thành phẩm

Nhận dạng

Sử dụng phương pháp thích hợp đã được cơ quan kiểm định quốc gia quy định.

Nhận dạng bằng phương pháp trung hòa vi lượng

Dùng kháng thể đặc hiệu trung hoà vắc xin quai bị. Hỗn dịch virus quai bị – kháng thể sau khi trung hòa được gây nhiễm trên tế bào Vero một lớp. Thử nghiệm luôn có chứng âm và chứng dương đi kèm, đọc kết quả sau 2 tuần.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc xin đạt yêu cầu khi tế bào Vero không bị hủy hoại ở mẫu vắc xin, giống như mẫu chủng âm.
Cách tiến hành:
Ngày thứ nhất: Nuôi cấy tế bào trên phiến 6 giếng hoặc 24 giếng. Lượng tế bào 1.10⁵ – 1,5.10⁵ tế bào/ml hỗn dịch.

Ngày thứ 2: Trung hòa kháng nguyên bằng kháng thể đặc hiệu.
Pha loãng kháng thể theo các độ pha loãng khác nhau. Hoàn nguyên vắc xin.
Kết hợp kháng nguyên, kháng thể theo tỉ lệ thể tích 1 : 1 (phản ứng trung hoà).
Ủ hỗn dịch đã trung hòa (kháng nguyên – kháng thể) và hỗn dịch không trung hòa (chỉ có vắc xin ở các nồng độ 10^-1 , 10^-2 , 10^-3 , 10^-4 , 10^-5 ; và chỉ có kháng thể theo độ pha phù hợp  trong chu trình nhiệt thích hợp.
Khuyến cáo: Có thể dùng chu trình nhiệt như sau: đặt vào bể ổn định nhiệt 37 °C/30 min, 23 °C/30 min, 4 °C trong thời gian từ 18 h trở lên ( ≥ 18 h).
Ngày thứ 3:
Gây nhiễm tế bào: Nhỏ hỗn dịch đã trung hòa và không trung hòa vào các phiến tế bào. Có các giếng chứng tế bào, chứng vắc xin theo các nồng độ, chứng kháng thể theo các độ pha kèm theo.
Ủ ở tủ ấm 37 °C có 5 % CO₂
Theo dõi hàng ngày và đọc kết quả từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 7.

Giếng chứng tế bào vẫn phát triển bình thường.
Có xuất hiện hủy hoại trên tế bào Vero ở các nồng độ vắc xin pha loãng.

Nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR

Dùng mồi đặc hiệu cho virus quai bị. Có thông tin chi tiết về đoạn mồi này. Thử nghiệm bao gồm mẫu thử và chứng âm.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc xin đạt yêu cầu khi sản phẩm RT-PCR có bằng kích cỡ (size) đúng.
Khuyến cáo:
Có thể dùng cặp mỗi như sau:
Mồi xuôi 5′-AGT AGT GTC GAT GAT CTC AT-3’, Mồi ngược 5′-GCT CAA GCC TTG ATC ATT GA-3′.

Kích cỡ sản phẩm: 674 bp.
Chu trình nhiệt/thời gian:
50 °C/30 min;
95 °C/thời gian (theo hướng dẫn của bộ kít RT-PCR);

94 °C/1 min
55 °C/1 min } 40 chu kỳ,
72 °C/1 min

72 °C/10 min;

4 °C đến khi điện đi.

Hiệu giá vắc xin

Hiệu giá vắc xin quai bị được xác định bởi liều gây hủy hoại 50 % tế bào Vero (CCID₅₀ ).
Nguyên vật liệu:
Mẫu vắc xin quai bị thử nghiệm: 3 lọ, kèm theo nước hồi chỉnh.
Vắc xin quai bị mẫu chuẩn: 1 lọ
Hai chai tế bào Vero loại 75 cm² mọc đẹp, kín một lớp.

Các hóa chất:
PBS (Phosphate buffered Saline).
Trysin 0,25% EDTA.
MEM hoặc M199 có chứa 2 % FBS (huyết thanh bào thai bê).
Tiến hành:
Thử nghiệm được tiến hành trong tủ cấy vô trùng BSC class II, trong khu vực vô trùng.
Tiến hành trên ít nhất 3 thử nghiệm kép cho vắc xin mẫu thử và tính kết quả bằng giá trị trung bình nhân của 3 thử nghiệm đó.
Pha loãng vắc xin mẫu chuẩn và mẫu thử:
Ví dụ: Tiến hành pha loãng theo Bảng 1.

Bảng 1: Ví dụ về cách tiến hành pha loãng vắc xin

Độ pha loãng	Thể tích môi trường (ml)	Thể tích vắc xin (ml)
10-1.0 (A)	2,7	0,3
10-1.5 (B)	2,16	1 (từ A)
10-2.0 (C)	2,16	1 (từ B)
10-2.5 (D)	2,16	1 (từ C)
10-3.0 (E)	2,16	1 (từ D)
10-3.5 (F)	2,16	1 (từ E)
10-4.0 (G)	2,16	1 (từ F)
10-4.5 (H)	2,16	1 (từ G)
10-5.0 (K)	2,16	1 (từ H)

Tiến hành cho môi trường theo bảng trên vào các lọ thủy tinh nhỏ.
Hồi chỉnh vắc xin, lắc kỹ rồi lấy 0,3 ml cho vào độ pha loãng đầu tiên 10-1, lắc kỹ rồi lấy 1 ml nhỏ vào lọ có độ pha 10-15, tiếp tục quy trình tương tự đến độ pha cuối cùng. Chú ý thay đầu côn sau mỗi độ pha.
Sau khi pha loãng xong tiến hành nhỏ vào phiến theo hàng ngang, mỗi độ pha loãng nhỏ 10 giếng, mỗi giếng 100 µl. Nhỏ theo độ pha loãng từ thấp đến cao, nếu làm ngược lại phải thay đầu côn ở mỗi độ pha loãng.
Nhỏ vào 2 dãy giếng còn lại mỗi giếng 100 µl môi trường. Lặp lại quy trình trên với các lọ vắc xin còn lại và vắc xin chuẩn.
Sau khi pha loãng xong, cất phiến vào ngăn mát tủ lạnh (2 °C đến 8°C).
Tiến hành chuẩn bị hỗn dịch tế bào, lượng tế bào cần là 2 × 10 tế bào/ml.
Tế bào được nuôi cấy, tách, pha đủ lượng tế bào theo đậm độ nêu trên và đổ ra mảng.
Lấy phiến ra và tiến hành nhỏ tế bào lên tất cả các giếng, mỗi giếng 100 µl.

Cất vào tủ ấm 36 °C có 5 % CO₂. Đọc kết quả từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 9.

Cách đọc và tính kết quả:
Khi tiến hành đọc kết quả thì quan sát các giếng chứng dưới kính hiển vi phản pha trước để dễ phân biệt sự hủy hoại tế bào của virus với tế bào Vero phát triển bình thường. Chỉ cần có dấu hiệu huỷ hoại tế bào thì giếng đó được tính là “hủy hoại”.
Tính kết quả theo công thức Karber hoặc Reed – Muench như sau:

log CCID₅₀ = L – d x (S-0,5)

Trong đó:

L là log bậc pha loãng thấp nhất dùng trong phản ứng;

D là log hệ số pha loãng,
S là tổng số phần trăm các giếng hủy hoại.
Thử nghiệm có giá trị nếu:
Các giếng chứng tế bào mọc đẹp, không bị nhiễm nấm, vi khuẩn.
Hiệu giá của vắc xin chuẩn dao động trong vòng 0,5 log₁₀ so với hiệu giá vắc xin đã xác định của chuẩn.
Hiệu giá của 3 lọ vắc xin mẫu thử song song không lệch quá 0,5 log₁₀ .
Kết quả hủy hoại giảm dần theo độ pha loãng tăng dần của vắc xin.
Dãy các độ pha loãng sử dụng phải bao gồm được mức độ hủy hoại tế bào từ 0 % đến 100 %.
Tiểu chuẩn chấp thuận:
Hiệu giá virus của vắc xin quai bị xác định được không được nhỏ hơn lượng ghi trên nhãn. Hiệu giá virus tối thiểu ghi trên nhãn không được nhỏ hơn Ig10³ CCID₅₀ đối với một liều đơn cho người.

Tính ổn định nhiệt

Thử nghiệm tính ổn định của vắc xin quai bị được tiến hành trên nguyên tắc xác định hiệu giá mẫu thử khi được ủ ở 37 °C, so với mẫu được bảo quản ở (5 + 3) °C trong 7 ngày.
Tiến hành xác định hiệu giá virus theo phương pháp tương tự như mô tả ở trên.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Mẫu vắc xin đạt yêu cầu khi hiệu giá virus của mẫu ủ ở 37 °C không giảm quá 1kg so với vắc xin mẫu thử bảo quản ở (5 + 3) °C. Hiệu giá thấp nhất phải không được nhỏ hơn Ig10³ CCID₅₀ /0,5 ml (1 liều đơn dùng cho người).

An toàn chung (Phụ lục 15.11).

Vắc xin quai bị phải đạt yêu cầu về an toàn khi thử nghiệm trên chuột lang và chuột nhắt. Chuột phải khỏe mạnh và tăng trọng bình thường sau 7 ngày theo dõi.

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Độ ẩm tồn dư

Không được quá 3,0 % (Phụ lục 15.35).

Cảm quan

Đạt yêu cầu theo đăng ký của nhà sản xuất.

Mycoplasma

Không được có Mycoplasma (Phụ lục 15.36).

Khuyến cáo: Có thể sử dụng phương pháp PCR để xác định sự có mặt của Mycoplasma trong vắc xin quai bị.

Ovalbumin

Nếu vắc xin được sản xuất từ phôi gà hoặc chim, hàm lượng ovalbumin phải không được quá 1 µg ovalbumin/ liều đơn cho người, xác định hàm lượng này theo phương pháp hóa miễn dịch.

Albumin tồn dư

Nhỏ hơn 50 ng/liều đơn dùng cho người. Xác định bằng phương pháp hoá miễn dịch thích hợp.

Bảo quản

Vắc xin quai bị được bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng.

Xem thêm: HUYẾT THANH KHÁNG BẠCH HẦU (Immunoserum diphthericum) – Dược điển Việt Nam 5

Nhãn

Theo quy định hiện hành, và cần có các thông tin sau đây:

Tên chủng virus được sử dụng sản xuất

Loại tế bào sử dụng cho sản xuất;
Hiệu giá thấp nhất của virus;
Lượng kháng sinh còn tồn dư trong vắc xin, các chất bảo quản và hàm lượng của chúng (nếu có);
Bảo quản vắc xin trong điều kiện tránh ánh sáng,

Các yếu tố phải tránh tiếp xúc trực tiếp với vắc xin.

Cách dùng, liều dùng

Tiêm dưới da, liều 0,5 ml hoặc 0,7 ml (theo quy định của nhà sản xuất).