VẮC XIN RUBELLA (Vaccinum rubellae vivum) – Dược điển Việt Nam 5

Vắc xin rubella là một chế phẩm chứa virus rubella sống, giảm độc lực, dạng đông khô; được sản xuất từ các virus phát triển trên dòng tế bào thích hợp.
Hoàn nguyên vắc xin ngay trước khi sử dụng bằng nước hồi chỉnh như đã ghi trên nhãn, được dung dịch trong, có thể có màu nếu có chất chỉ thị pH.
Chế phẩm phải đáp ứng các yêu cầu dưới đây:

Sản xuất

Chủng sản xuất

Sản xuất được dựa trên hệ thống chủng gốc virus giảm độc lực, được phê duyệt bởi Cơ quan Kiểm định quốc gia. Chủng virus rubella dùng để sản xuất vắc xin sẽ phải được xác định bằng hồ sơ ghi chép lịch sử chủng bao gồm những thông tin về chủng gốc và các đời nhân lên tiếp theo của chủng này. Chủng sản xuất được bảo quản ở dạng đông khô trong điều kiện nhiệt độ dưới âm 20 °C (-20 °C), nếu không đông khô phải được bảo quản ở nhiệt độ dưới âm 60 °C (-60 °C) và được giám sát chặt chẽ nhiệt độ trong quá trình bảo quản.
Chủng sản xuất phải tuân thủ các điều kiện dưới đây:

Nhận dạng:
Các lô chủng gốc và chủng sản xuất phải được nhận dạng virus rubella bằng phương pháp trung hòa với kháng huyết thanh đặc hiệu rubella trên nuôi cấy tế bào hoặc nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR.
Hàm lượng virus:
Hàm lượng virus của các lô chủng gốc và chủng sản xuất phải được kiểm tra để đảm bảo tính ổn định của sản xuất.

Các yếu tố ngoại lai:
Lô chủng sản xuất phải tuân thủ các yêu cầu đối với đối với các lô chung sản xuất vắc xin, không được có các yếu tố ngoại lai.
Độc lực:
Lô chủng sản xuất phải tuân thủ yêu cầu về thử nghiệm kiểm tra độc lực của các vắc xin sống. Khi Macaca và Cercopithecus phù hợp với thử nghiệm này.

Xem thêm: VẮC XIN QUAI BỊ (Vaccinum parotitidis vivum) – Dược điển Việt Nam 5

Tế bào sản xuất

Sử dụng ngân hàng tế bào sản xuất hoặc từ tế bào phôi có nguồn gốc từ trứng không có tác nhân gây bệnh (SPF) và được Cơ quan kiểm định quốc gia phê chuẩn.

Huyết thanh dùng trong môi trường nuôi cấy tế bào

Huyết thanh dùng để nhận tế bào dùng cho sản xuất vắc xin rubella phải được kiểm tra và chứng minh là đạt yêu cầu vô khuẩn (không có vi khuẩn, nấm và Mycoplasma và chứng minh không chứa virus).
Huyết thanh người không được sử dụng trong tất cả các nuôi cấy của quá trình sản xuất vắc xin.

Quy trình sản xuất và kiểm định sản xuất

Chủng virus rubella được phát triển trên tế bào phôi hoặc tế bào từ ngân hàng tể bào sử dụng môi trường thích hợp. Hỗn dịch virus được gặt, hộn, bổ sung chất bảo quản, lọc, pha loãng, đóng lọ và đông khô theo quy trình đã được phê chuẩn. Trong quá trình sản xuất, tất cả các khâu đều được kiểm tra từ nguyên liệu nguồn (trứng, môi trường sử dụng cho sản xuất, huyết thanh bào thai bê, trypsin tách tế bào,…); tế bào sử dụng cho sản xuất, mẻ gặt đơn, loạt hỗn dịch virus hộn, vắc xin bán thành phẩm trung gian, vắc xin bán thành phẩm cuối cùng, vắc xin thành phẩm được kiểm tra tác nhân ngoại lai, kiểm tra hiệu giá virus, kiểm tra tính vô khuẩn…

Tất cả quá trình sản xuất ngân hàng tế bào và các nuôi cấy tế bảo tiếp theo sau đó phục vụ cho quá trình sản xuất vắc xin rubella đều phải được tiến hành trong các điều kiện vô trùng, trong khu vực không lưu giữ các dòng tế bào khác. Huyết thanh động vật có thể được sử dụng trong môi trường nuôi cấy của quá trình sản xuất. Huyết thanh và trypsin dùng để pha chế huyền dịch tế bào và pha môi trường nuôi cấy sẽ phải cho thấy không chứa các yếu tố ngoại lai. Môi trường nuôi cấy tế bào có thể chứa một chỉ thị pH như đỏ phenol và lượng kháng sinh nhỏ nhất có tác dụng.

Kiểm định mẻ gặt đơn

Mỗi mẻ gặt đơn phải đạt các tiêu chuẩn dưới đây mới được sử dụng để pha chế vắc xin bán thành phẩm cuối cùng:

Nhận dạng

Mẻ gặt đơn chứa virus rubella sẽ phải được nhận dạng virus bằng phương pháp trung hòa huyết thanh trên mỗi trường nuôi cấy có sử dụng kháng thể đặc hiệu hoặc bằng phương pháp PCR.

Nồng độ virus

Nồng độ virus trong mỗi mẻ gặt đơn phải được xác định để giám sát tính ổn định của sản xuất và từ đó xác định độ pha được dùng cho vắc xin bán thành phẩm cuối cùng.

Các yếu tố ngoại lai

Mỗi mẻ gặt đơn đều phải kiểm tra để xác định không chứa các yếu tố ngoại lai.

Kiểm tra tế bào và trứng

Nếu sử dụng tế bào lưỡng bội người cho sản xuất, phải kiểm tra tế bào chứng để nhận dạng; các tế bào chứng và trứng chứng phải được kiểm tra để xác định không chứa các yếu tố ngoại lai.
Vắc xin rubella sống giảm độc lực có thể được điều chế với chất ổn định thích hợp và đông khô ở dạng vắc xin đơn hoặc phối hợp với vắc xin sởi và quai bị sống giảm độc lực.

Kiểm định vắc xin bán thành phẩm cuối cùng

Các mẻ gặt đơn vắc xin đạt các yêu cầu nêu trên sẽ được hộn lại và lọc để loại bỏ tế bào. Thêm chất ổn định thích hợp và các mẻ gặt đã được hộn sẽ được pha thành độ pha loãng thích hợp.
Mỗi lô vắc xin bán thành phẩm cuối cùng sẽ phải đạt các yêu cầu dưới đây mới được tiếp tục tiến hành các bước tiếp theo để sản xuất vắc xin thành phẩm.
Vô khuẩn: Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Kiểm định vắc xin thành phẩm

Nhận dạng

Sử dụng phương pháp thích hợp đã được cơ quan kiểm định quốc gia phê chuẩn.

Nhận dạng bằng phương pháp trung hòa vi lượng

Dùng kháng thể đặc hiệu trung hòa vắc xin rubella. Hỗn dịch virus rubella – kháng thể sau phản ứng, được dùng để gây nhiễm trên tế bào RK-13 một lớp. Thử nghiệm luôn có chứng âm và chứng dương đi kèm, đọc kết quả sau 2 tuần.

Tiến hành:
Ngày thứ nhất:
Nuôi cấy tế bào trên phiến 6 giếng hoặc 24 giếng.

Lượng tế bào: 1.10⁵ tế bào/ml đến 1,5.10⁵ tế bào ml hỗn dịch.

Ngày thứ 2:
Pha kháng thể theo các độ pha loãng khác nhau.
Hoàn nguyên vắc xin bằng nước hồi chỉnh kèm theo. Trộn kháng nguyên, kháng thể theo tỉ lệ thể tích 1 : 1 (phản ứng trung hoà).
Ủ hỗn dịch đã trung hòa (có kháng nguyên và kháng thể) và hỗn dịch không trung hòa (chỉ có vắc xin ở các nồng độ 10^-1 , 10^-2 , 10^-3 , 10^-4 , 10^-5 ; và chỉ có kháng thể theo độ pha phù hợp) trong chu trình nhiệt thích hợp.
Khuyến cáo: Có thể dùng chu trình nhiệt như sau: đặt vào bể ổn định nhiệt 37 °C/30 min, 23 °C/ 30 min, 4 °C trong 18 h trở lên (≥ 18 h).
Ngày thứ 3:
Gây nhiễm trên tế bào: Nhỏ hỗn dịch đã trung hòa và không trung hòa vào các giếng trên phiến tế bào đã chuẩn bị trước. Phải có các giếng chứng tế bào, chứng vắc xin theo các nồng độ, chứng kháng thể theo các độ pha kèm theo. Đặt vào tủ ẩm 32 °C có 5 % CO₂

Theo dõi hàng ngày và đọc kết quả từ ngày thứ 4 cho đến ngày thứ 7. Thử nghiệm có giá trị khi ở giếng chứng âm tế bào vẫn phát triển bình thường: trong khi đó, có xuất hiện hủy hoại tế bào ở giếng chứng dương.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc xin đạt yêu cầu khi tế bào RK-13 không bị hủy hoại ở giếng chứa vắc xin, giống như mẫu chứng âm.

Nhận dạng bằng phương pháp RT-PCR

Dùng mồi đặc hiệu cho virus rubella. Có thông tin chi tiết về đoạn mồi này. Thử nghiệm bao gồm mẫu thử và chứng âm.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Vắc xin đạt yêu cầu khi sản phẩm RT-PCR có băng kích cỡ (size) đúng.
Khuyến cáo:
Có thể dùng cặp mỗi như sau:
Mồi xuôi: 5-CAA CÁC GCC GCA CGG ACA AC-3′.

Mồi ngược: 5’-CCA CAA GCC GCG AGC AGT CA-3′.

Kích thước: 185 bp.
Chu trình nhiệt thời gian:
50 °C/30 min;
95 °C/thời gian (theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR);

94 °C/1 min
60 °C/1 min } 35 chu kỳ;
72 °C/1 min

72 °C/10 min
4 °C/đến khi điện di.

Hiệu giá vắc xin

Nguyên tắc: Hiệu giá vắc xin rubella được xác định bởi liều gây hủy hoại 50 % tế bào RK-13 (CCID₅₀ ).
Vật liệu:
Mẫu vắc xin rubella thử nghiệm: 3 lọ, kèm theo nước hồi chỉnh. Vắc xin rubella mẫu chuẩn: 1 lọ
Hai chai tế bào RK-13 loại 75 cm² mọc đẹp, kín một lớp.

Hóa chất:
PBS: Phosphate buffered Saline
Trysin 0,25% EDTA
MEM 2 % đến 5 % FBS (huyết thanh bào thai bê)
Tiến hành
Thử nghiệm được tiến hành trong tủ cấy vô trùng BSC class II, trong khu vực vô trùng.
Tiến hành trên ít nhất 3 thử nghiệm kép cho 3 lọ vắc xin mẫu thử riêng biệt và tính kết quả bằng giá trị trung bình nhân của 3 thử nghiệm đó.
Pha loãng vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin mẫu thử từ độ pha từ 10^-1 đến 10^-5
Ví dụ: Tiến hành pha loãng như Bảng I.

Độ pha loãng	Thể tích môi trường (ml)	Thể tích vắc xin (ml)
10-1.0 (A)	2,7	0,3
10-1.5 (B)	2,16	1 (từ A)
10-2.0 (C)	2,16	1 (từ B)
10-2.5 (D)	2,16	1 (từ C)
10-3.0 (E)	2,16	1 (từ D)
10-3.5 (F)	2,16	1 (từ E)
10-4.0 (G)	2,16	1 (từ F)
10-4.5 (H)	2,16	1 (từ G)
10-5.0 (K)	2,16	1 (từ H)

Cho môi trường theo bảng trên vào các lọ hoặc ống thủy tinh vô khuẩn có thể tích 3 ml đến 6 ml.
Hồi chỉnh vắc xin, lắc kỹ rồi lấy 0,3 ml cho vào độ pha loãng đầu tiên 10^-1
Lắc kỹ, lấy 1 ml nhỏ vào lọ có độ pha 10^-1.5 ,
Tiếp tục quy trình tương tự đến độ pha cuối cùng. Chú ý thay đầu côn sau mỗi độ pha.
Sau khi pha loãng xong, tiến hành nhỏ vào phiến vi chuẩn độ theo hàng ngang, mỗi độ pha loãng nhỏ 10 giếng, mỗi giếng 100 µl.
Nhỏ theo độ pha loãng từ thấp đến cao, nếu làm ngược lại phải thay đầu côn ở mỗi độ pha loãng.
Nhỏ vào 2 dãy giếng còn lại mỗi giếng 100 µl môi trường. Mỗi lọ vắc xin thực hiện một quy trình riêng biệt như trên. Lặp lại quy trình trên với lọ vắc xin còn lại và vắc xin chuẩn. Cất các phiến đã nhỏ xong vào tủ lạnh (2 °C đến 8°C). Tiến hành chuẩn bị hỗn dịch tế bào: Lượng tế bào cần là từ 1 × 10⁵ tế bào/ml đến 2 × 10⁵ tế bào/ml.
Nuôi cấy, tách tế bào và pha đủ thể tích tể bào cần dùng với đậm độ thích hợp nêu trên rồi đổ ra máng.
Lấy phiến ra và tiến hành nhỏ tế bào lên tất cả các giếng, mỗi giếng 100 µl.
Ủ ở tủ ẩm 32 °C trong khoảng 12 ngày.
Đọc kết quả từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 12.

Cách đọc và tính kết quả:
Khi tiến hành đọc kết quả thì quan sát các giếng chứng trên kính hiển vi phản pha trước để dễ phân biệt sự hủy hoại tế bảo của virus với các tế bào RK-13 phát triển bình thường. Dấu hiệu hủy hoại là tế bào co lại tạo thành tế bào khổng lồ đa nhân, tạo những khoảng trống trên mặt đáy phiến, chỉ cần có dấu hiệu huỷ hoại tế bào thì giếng đó được tính là “hủy hoại”.
Tính kết quả theo công thức Karber hoặc Reed – Muench:

log CCID₅₀ =L-d (S-0,5)

Trong đó:
L là log bậc pha loãng thấp nhất dùng trong phản ứng

d là log hệ số pha loãng,
S là tổng số phần trăm các giếng hủy hoại.
Thử nghiệm có giá trị nếu:
Các giếng chứng tế bào mọc đẹp, không bị nhiễm nấm, vi khuẩn.

Hiệu giá của vắc xin chuẩn dao động trong vòng 0,5log₁₀ so với hiệu giá vắc xin đã xác định của chuẩn.
Hiệu giá của 3 lọ vắc xin mẫu cần kiểm tra song song không lệch quá 0,5log₁₀
Kết quả hủy hoại giảm dần theo độ pha loãng tăng dần của vắc xin.
Dãy các độ pha loãng sử dụng phải bao gồm được mức độ hủy hoại tế bào từ 0 % đến 100 %.
Tiêu chuẩn chấp thuận:
Hiệu giá virus của vắc xin rubella cần kiểm tra không được nhỏ hơn lượng ghi trên nhãn. Hiệu giá virus tối thiểu ghi trên nhân không được nhỏ hơn lg10³ CCID₅₀ , đối với một liều đơn cho người.

Tính ổn định nhiệt

Thử nghiệm tính ổn định của vắc xin rubella được tiến hành bằng cách so sánh hiệu giá của mẫu vắc xin cần kiểm tra được ủ ở 37 °C với mẫu được ủ ở (5 ± 3) °C, trong 7 ngày.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Tính ổn định nhiệt của vắc xin đạt yêu cầu khi hiệu giá virus của vắc xin mẫu được ủ ở 37 °C không giảm quá 1kg so với vắc xin mẫu ủ ở (5 ± 3) °C. Hiệu giá thấp nhất không được nhỏ hơn lg10³ CCID₅₀/0,5 ml (1 liều đơn dùng cho người).

An toàn chung (Phụ lục 15.11)

Vắc xin rubella phải an toàn khi thử nghiệm trên chuột lang và chuột nhắt.
Tiêu chuẩn chấp thuận: Chuột phải khỏe mạnh và tăng trọng bình thường sau 7 ngày theo dõi.

Vô khuẩn

Đạt yêu cầu vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Độ ẩm

Không được quá 3,0 % (Phụ lục 15.35).

Cảm quan

Đạt yêu cầu theo đăng ký của nhà sản xuất.

Mycoplasma

Không được có Mycoplasma (Phụ lục 15.36).
Khuyến cáo: Có thể dùng phương pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc PCR để phát hiện Mycoplasma trong vắc xin.

Albumin tồn dư

Nhỏ hơn 50 ng/liều đơn dùng cho người. Xác định bằng phương pháp hoá miễn dịch thích hợp.

Bảo quản

Bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng.

Xem thêm: HUYẾT THANH MIỄN DỊCH DÙNG CHO NGƯỜI (Immunosera ad usunt humanum)- Dược điển Việt Nam 5

Nhãn

Theo quy định hiện hành và cần có các thông tin như sau:

Tên chủng virus được sử dụng sản xuất.
Loại tế bào sử dụng cho sản xuất.
Nồng độ thấp nhất của virus.
Lượng kháng sinh còn tồn dư trong vắc xin, các chất bảo quản và liều lượng của chúng (nếu có).

Các yếu tố phải tránh tiếp xúc trực tiếp với vắc xin.

Chú ý: Vắc xin quai bị nhạy cảm với ánh sáng, vì vậy phải bảo quản tránh ánh sáng đối với vắc xin đông khô và vắc xin đã hoàn nguyên.
Phụ nữ mang thai và những phụ nữ sắp có thai trước hai tháng: Không nên tiêm vắc xin này.

Cách dùng, liều dùng

Tiêm dưới da, liều 0,5 ml.