PHỤ LỤC 15.21
Xác định công hiệu (hiệu giá) của vắc xin bại liệt uống gồm 2 nội dung:
Xác định hiệu giá virus trong vắc xin bán thành phẩm (đơn týp).
Xác định hiệu giá virus trong vắc xin thành phẩm (tam liên).
Xác định hiệu giá virus trong vắc xin bán thành phẩm (đơn týp)
Nguyên tắc
Công hiệu của vắc xin phòng bại liệt uống được xác định bởi liều gây hủy hoại 50 % tế bào cảm thụ Hep-2 Cincinnati (CCID50) trong phương pháp vi lượng.
Tiến hành
Pha loãng bậc 10 mẫu chuẩn và vắc xin cần thử từ 10-1 đến 10-8 bằng môi trường duy trì tế bào.
Cho 0,1 ml các đậm độ virus vào mỗi giếng của phiến nhựa, mỗi đậm độ dùng từ 8 giếng đến 10 giếng.
Cho 0,1 ml hỗn dịch tế bào chứa 1.104 tế bào Hep-2 vào mỗi giếng.
Đậy nắp phiến nhựa và cho các phiến nhựa vào tủ 5% C02, nhiệt độ nuôi cấy là 36 °C trong 7 ngày.
Theo dõi
Theo dõi sự hủy hoại của tế bào từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.
Tính kết quả
Đọc kết quả cuối cùng vào ngày thứ 7 và xử lý số liệu theo phương pháp thống kê Reed-Mucnch hoặc Karber.Thí nghiệm có giá trị nếu hiệu giá của vắc xin mẫu chuẩn sai số ±0,5 so với hiệu giá đã biết (tính theo log10 hiệu giá).
Xác định hiệu giá của vắc xin bại liệt uống trong thành phẩm tam liên
Nguyên tắc
Vắc xin bại liệt uống tam liên bao gồm 3 týp virus bại liệt sống giảm độc, do đó cần xác định hiệu giá của từng týp thành phần (týp 1, týp 2, týp 3) và hiệu giá tổng cả 3 týp (týp 1 + týp 2 + týp 3). Muốn chuẩn độ hiệu giá của từng týp phải dùng kháng huyết thanh (KHT) đặc hiệu để trung hoà 2 týp còn lại. Hiệu giá của vắc xin Sabin được tính bằng lượng virus Sabin gây hủy hoại 50 % tế bào cảm thụ trong 1 liều dùng cho người (số CCID50/0,1 ml) (CCID50 Cell Culture Infective Dose).
Các bước tiến hành
Pha loãng bậc 0,5 log10 vắc xin mẫu chuẩn và vắc xin thử bằng môi trường duy trì.
Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 1 chứa kháng huyết thanh týp 2 và týp 3.
Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 2 chứa kháng huyết thanh týp 1 và týp 3.
Pha hỗn dịch kháng huyết thanh số 3 chứa kháng huyết thanh týp 1 và týp 2.
Cho 0,05 ml/giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 1 vào phiến số 1 (xác định hiệu giá týp 1).
Cho 0,05 ml/giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 2 vào phiến số 2 (xác định hiệu giá týp 2).
Cho 0,05 ml/giếng hỗn dịch kháng huyết thanh số 3 vào phiến số 3 (xác định hiệu giá týp 3).
Cho 0,05 ml/giếng môi trường duy trì vào tất cả các giếng của phiến số 4 (xác định hiệu giá tổng).
Cho 0,05 ml của từng độ pha loãng vắc xin vào các dãy tương ứng của cả 4 phiến, mỗi độ pha loãng gây nhiễm 8 giếng. Bắt đầu gây nhiễm từ độ pha loãng cao nhất. Thêm 0,05 ml môi trường duy trì vào các giếng chứng huyết thanh (SC – serum control) và chứng tế bào (CC- cell control).
Đậy nắp phiến cho vào tủ ấm 5% C02. Trong trường hợp để tủ ấm thường thì gói kín trong giấy bạc hoặc trong túi nilon.
Ủ ở nhiệt độ 36 °C trong vòng 3 h để virus và kháng huyết thanh đặc hiệu kết hợp với nhau.
Chuẩn bị hỗn dịch tế bào Hep-2 nồng độ 1 – 2 X 107 ml rồi cho 0,1 ml hỗn dịch này vào toàn bộ các giếng của cả 4 phiến. Nồng độ này thường đảm bảo tế bào sẽ mọc thành 1 lớp trên phiến trong vòng 2 ngày đến 3 ngày.
Đậy nắp phiến rồi cho vào tủ ấm 5% C02. Trong trường hợp để ở tủ ấm thường thì dán kín bằng màng dán phiến (microtest film), ủ ở 36 °C trong 7 ngày.
Theo dõi và tính kết quả
Theo dõi sự hủy hoại của tế bào và tính kết quả như đã trình bày ở phần trên. Tế bào ở các giếng chứng huyết thanh và chứng tế bào phải phát triển tốt.
Vắc xin thành phẩm coi như đạt yêu cầu nếu:
Týp 1 có ít nhất 106,0 CCID50/0,1ml
Týp 2 có ít nhất 105,0 CCID50/0,1ml
Týp 3 có ít nhất 105,5 CCID50/0,1ml
Toàn bộ qui trình xác định công hiệu của vắc xin bại liệt uống phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn
