PHỤ LỤC 15.1
Kiểm tra độ sống
Các vật liệu
Dung dịch Sauton loãng 1/4 được sử dụng để pha loãng vắc xin BCG.
Môi trường nuôi cấy: Lowenstein – Jensen.
Vắc xin BCG mẫu thử và mẫu chuẩn.
Hoàn nguyên và pha loãng vắc xin
Vắc xin BCG được xác định độ sống theo phương pháp sau: Hoàn nguyên ít nhất 5 mg vắc xin BCG vào 5 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 vô khuẩn để tạo hỗn dịch cơ bản chứa 1 mg vắc xin BCG/1 ml. Sau khi hoàn nguyên, hỗn dịch này phải được giữ ở 4 °C trong thời gian tối thiểu 15 min, sau đó pha theo công thức sau:
1) 1 ml hỗn dịch cơ bản +99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/100 (I).
2) 1 ml hỗn dịch pha loãng I +99 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/10 000 (II).
3) 4 ml hỗn dịch pha loãng II + 4 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/20 000 (III).
4) 2 ml hỗn dịch pha loãng II + 6 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 = 1/40 000 (IV).
5) 2 ml hỗn dịch pha loãng II +14 ml dung dịch Sauton loãng 1/4= 1/80 000 (V).
6) 2 ml hỗn dịch pha loãng II +30 ml dung dịch Sauton loãng 1/4 =1 /160 000 (VI).
Nuôi cấy
Lắc đều hỗn dịch của mỗi độ pha trong 20 s, cấy vào môi trường Lowenstein – Jensen 0,1 ml/ống theo trình tự sau:
2 độ pha đầu: Mỗi độ pha loãng cấy lên 5 ống môi trường.
Độ pha thử 3 cấy lên 10 ống môi trường.
Đối với vắc xin tươi (trước khi đông khô): cấy lên các ống môi trường Lowenstein – Jensen huyền dịch vắc xin BCG từ 3 độ pha loãng cuối IV, V, VI.
Đối với vắc xin BCG đông khô giữ ở 4 °C: cấy huyền dịch vắc xin BCG từ 3 độ pha loãng III, IV, V.
Đối với vắc xin BCG đông khô ủ ở 37 °C: cấy huyền dịch vắc xin BCG từ 3 độ pha loãng II, III, IV.
Các ống môi trường đã được cấy huyền dịch vắc xin BCG ở các độ pha khác nhau như trên sẽ được láng đều, để khô bề mặt và ủ ở 37 °C trong 28 ngày.
Đếm khuẩn lạc
Các ống môi trường được cấy huyền dịch BCG và ủ ở 37 °C sẽ được đưa ra đếm số khuẩn lạc mọc trên từng ống sau 21 ngày và 28 ngày.
Tính kết quả
Số đơn vị sống trong 1 ml vắc xin được tính theo 1 trong 4 công thức ở Bảng 15.1,Hoặc kết quả độ sống của mỗi loại vắc xin BCG có thể được tính theo chương trình phần mềm Whoprogram/BCG/Biofarma.
Tại nhà sản xuất, tiến hành kiểm tra độ sống ở tất cả các loại vắc xin thành phẩm (bao gồm cả độ sống trước đông khô, sau đông khô và sau khi ủ ổn định nhiệt).
Những loại vắc xin BCG có độ sống không đảm bảo với giới hạn cho phép ở lần kiểm tra thứ nhất phải nhắc lại thử nghiệm: Nếu thử nghiệm độ sống lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị (valid test), phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường Lowenstein-Jensen gấp đôi so với lần 1. Nếu thử nghiệm độ sống lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm không có giá trị (invalid test) thì chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường bằng lần 1. Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, độ sống vẫn không đạt thì phải hủy bỏ loạt vắc xin BCG đó.
Kiểm tra độ sống của vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống. Độ sống của vắc xin BCG mẫu chuẩn trong mỗi thử nghiệm phải ổn định và nằm trong giới hạn giá trị trung bình ± 2SĐ.
Tiêu chuẩn chấp thuận
Đối với vắc xin BCG phòng bệnh lao, giới hạn độ sống cho phép là từ 1 triệu đến 6 triệu đơn vị sống trong 1 mg vắc xin (1x 106 ĐVS/mg đến 6x 106 ĐVS/mg vắc xin BCG).
Kiểm tra tính ổn định nhiệt
Số đơn vị sống của vắc xin BCG sau khi ủ ở 37 °C trong 28 ngày phải đạt ít nhất là 20 % so với mẫu ủ ở 4 °C trong 28 ngày.
Các vật liệu
Dung dịch Sauton loãng 1/4 được sử dụng để pha loãng vắc xin BCG.
Môi trường nuôi cấy: Lowenstein-Jensen.
Vắc xin BCG mẫu thử và mẫu chuẩn.
Trước khi kiểm tra tính ổn định nhiệt, vắc xin BCG đông khô mẫu thử phải được ủ ở các nhiệt độ khác nhau trong 28 ngày như dưới đây:
Dạng 1 mg/ống: ủ 10 ống ở 4 °C trong 28 ngày và 10 ống ở 37 °C trong 28 ngày.
Dạng 0,5 mg/ống: ủ 20 ống ở 4 °C trong 28 ngày và 20 ống ở 37 °C trong 28 ngày.
Tiến hành
Kiểm tra tính ổn định nhiệt của vắc xin BCG bằng cách đếm độ sống của loạt vắc xin này sau khi ủ ở 4 °C và 37 °C trong 28 ngày. Quy trình đếm độ sống được thực hiện như ở phần Kiểm tra độ sống. Tính tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc ở 37 °C so với ở 4 °C, theo công thức sau:
Tỷ lệ % ổn định nhiệt = (A / B ) X 100 (%)
Trong đó:
A là số ĐVS/mg vắc xin BCG ở 37 °C trong 28 ngày;
B là số ĐVS/mg vắc xin BCG ở 4 °C trong 28 ngày.
ĐVS là đơn vị sống.
Những loạt vắc xin BCG có tỷ lệ % ổn định nhiệt không đạt yêu cầu ở lần kiểm tra thứ nhất phải nhắc lại thử nghiệm theo yêu cầu như sau:
Nếu thử nghiệm có tỷ lệ % ổn định nhiệt lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm có giá trị, phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường Lowenstein-Jensen gấp đôi so với lần 1.
Nếu thử nghiệm có tỷ lệ % ổn định nhiệt lần 1 không đạt yêu cầu nhưng thử nghiệm không có giá trị thì chỉ cần nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu và số ống môi trường bằng lần 1.
Nếu lần thử nghiệm nhắc lại, tỷ lệ % ổn định nhiệt vẫn không đạt thì phải hủy bỏ loạt vắc xin BCG đó.
Kiểm tra tỷ lệ % ổn định nhiệt của vắc xin BCG phải tiến hành song song với vắc xin BCG mẫu chuẩn để kiểm tra chất lượng môi trường dùng cho thử nghiệm độ sống. Độ sống của vắc xin BCG mẫu chuẩn trong mỗi thử nghiệm phải ổn định và nằm trong giới hạn giá trị trung bình ± 2SĐ.
Tiêu chuẩn chấp thuận
Tỷ lệ % số đơn vị sống BCG mọc ở 37 °C so với ở 4 °C phải không được thấp hơn 20 %.
