PHỤ LỤC 15.34
Protein có trong vắc xin và sinh phẩm được xác định theo nhiều phương pháp khác nhau, tùy theo từng loại vắc xin và sinh phẩm.
Phương pháp Lowry
Nguyên lý
Protein có trong mẫu vắc xin thử bị tủa với acid tricloroacetic nóng. Xác định lượng tủa để tính ra lượng protein có trong vắc xin, sinh phẩm.
Phương pháp tiến hành:
Pha loãng mẫu thử (nếu cần thiết) để chỉnh hàm lượng protein của mẫu thử trong khoảng 20 μg/ml đến 120 μg/ml. Thêm 1 ml dung dịch acid tricloroacetic 10 % vào một ống nghiệm có chứa 1 ml mẫu thử. Đun nóng ở 80 °C trong nồi cách thủy trong 15 min. Làm nguội ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm ở tốc độ 3500 r/min trong 30 min, loại bỏ phần dung dịch nước.
Thêm vào phần lắng cặn 2 ml dung dịch acid tricloroacetic 5 %. Lắc kỹ trên máy lắc và ly tâm lại một lần nữa ở tốc độ 3500 r/min trong 30 min, loại bỏ phần dung dịch nước.
Thêm 2,5 ml dung dịch Alkalin vào mỗi ống nghiệm nêu trên và ủ ở nhiệt độ phòng (thời gian ủ tùy từng loại mẫu thừ) để hòa tan phần lắng cặn.
Thêm 2,5 ml nước cất và 0,5 ml thuốc thử Folin (pha loãng 1/2), ủ ở 37 °C trong 30 min. Ly tâm với tốc độ 3500 r/min đến 6000 r/min trong 30 min (với các chế phẩm chứa chất hấp phụ nhôm). Đo mật độ quang học ở bước sóng 750 nm trên quang phổ kế.
Song song tiến hành thử nghiệm với mẫu trắng: thay vào 1 ml mẫu thử là 1 ml nước cất.
Dựng đường chuẩn:
Dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn (dung dịch albumin chuẩn ở các nồng độ 25 μg/ml; 50 μg/ml; 100 μg/ml; 150 μg/ml). Dựa vào hàm lượng protein tìm được trên đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.
Cách pha dung dịch Alkalin (pha ngay trước khi dùng):
Dung dịch đồng sulfat pentahydrat 2 %: Hòa tan 2 g đồng sulfat pentahydrat vào vừa đủ 100 ml nước cất. Dung dịch natri tartrat 4 %: Hòa tan 4 g natri tartrut trong vừa đủ 100 ml nước cất.Trộn lẫn 2 dung dịch trên được dung dịch A.
Hòa tan 0,8 g natri hydroxyd và 4 g natri carbonat trong vừa đủ 100 ml nước cất được dung dịch B.
Trộn 50 ml dung dịch B và 1 ml dung dịch A được dung dịch Alkalin.
Đo độ hấp thụ thực của protein ở bước sóng 280 nm
Nguyên lý:
Protein trong dung dịch hấp thụ tia tử ngoại ờ bước sóng 280 nm, do sự có mặt các amino acid dây thơm, chủ yếu là tyrosin và tryptophan trong cấu trúc protein.
Phương pháp tiến hành:
Dung dịch thử: Pha loãng mẫu thử đến hàm lượng protein trong khoảng 0,2 mg/ml đến 2 mg/ml bằng dung dịch đệm thích hợp.
Dung dịch chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn bằng cùng dung dịch đệm với mẫu thử và có hàm lượng protein tương ứng với mẫu thử.
Giữ dung dịch thử và chuẩn ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ các dung dịch này bằng cóng thạch anh ở bước sóng 280 nm (Phụ lục 4.1), dùng nước cất làm mẫu trắng.
Hàm lượng protein trong mẫu thử (Cu) được tính bởi công thức:
Cu = Cs (Au/As)
Trong đó:
Cs là hàm lượng protein trong dung dịch chuẩn;
Au là độ hấp thụ của mẫu thử;
As là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn.
Phương pháp Bradford
Nguyên lý:
Dựa trên sự kết hợp giữa thuốc nhuộm Coomasie với protein trong môi trường acid.
Phương pháp tiến hành :
Pha loãng mẫu thử bằng nước cất đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn BSA (bovine serum albumin) có hàm lượng trong khoảng 0,1 mg/ml đến 1 mg/ml. Dùng nước cất làm mẫu trắng.
Thêm 2,5 ml thuốc nhuộm Coomasie 20 % vào 0,05 ml mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử, lắc đều. Để yên 10 min ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 595 nm (không dùng cóng thạch anh do sẽ bị thuốc nhuộm gắn vào).
Hàm lượng protein trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn.
Phương pháp đồng/acid bicinchoninic
Nguyên lý:
Dựa vào sự khử của ion Cu2+ thành Cu do protein, dùng acid bicinchoninic (BCA) để xác định Cu+.
Phương pháp tiến hành:
Pha loãng mẫu thử bằng nước cất đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.
Pha dung dịch chuẩn bằng nước cất (không ít hơn 5 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng 10 μg/ml đến 1200 μg/ml.
Dùng nước cất làm mẫu trắng.Thêm 2 ml thuốc thử đồng-BCA vào 0,1 ml mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử, lắc đều. Ủ trong nồi cách thủy 37 °C trong 30 min. Làm nguội ở nhiệt độ phòng trong 60 min, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) ở bước sóng 562 nm, dùng cóng thạch anh.
Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.
Pha thuốc thử BCA: Hòa tan 10 g dinatri bicinchoninat, 20 g natri Carbonat monohydrat, 1,6 g natri tatrat, 4 g natri hydroxyd và 9,5 g natri hydrogen Carbonat vào nước cất. Điều chỉnh đến pH 11,25 nếu cần bằng dung dịch natri hydroxyd hoặc dung dịch natri hydrogen carbonat. Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều.
Pha thuốc thử đồng-BCA: Trộn 1 ml dung dịch đồng Sulfat 40 g/l với 50 ml thuốc thử BCA.
Phương pháp biuret
Nguyên lý:
Dựa vào sự tương tác của ion Cu2+ với protein trong dung dịch alkalin, sản phẩm thu được có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 545 nm.
Phương pháp tiến hành:
Pha loãng mẫu thử bằng dung dịch nước muối sinh lý đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.
Pha dung dịch chuẩn bằng dung dịch nước muối sinh lý (không ít hơn 3 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng từ 0,5 mg/ml đến 10 mg/ml.
Dùng dung dịch nước muối sinh lý làm mẫu trắng.
Lấy một thể tích dung dịch mẫu thử, thêm đồng lượng dung dịch natri hydroxyd 60 g/l, lắc đều. Ngay lập tức cho thuốc thử biuret với lượng bằng 0,4 lần thể tích dung dịch mẫu thử và lắc nhanh. Để yên ở nhiệt độ phòng 15 min.
Trong vòng 90 min sau khi cho thuốc thử biuret, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) của mẫu thử ở bước sóng 545 nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng và mẫu chuẩn.
Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.
Pha thuốc thử biuret: Hòa tan 3,46 g đồng Sulfat (TT) trong 10 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch A). Hòa tan 34,6 g natri citrat (TT) và 20 g natri carbonat khan (TT) vào 80 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch B). Trộn dung dịch A và B, thêm nước cất vừa đủ 200 ml. Dùng trong 6 tháng, không dùng nếu thấy vẩn đục hoặc có tủa.
Phương pháp quang phổ huỳnh quang
Nguyên lý:
Dựa vào dẫn xuất của protein với o-phthaldehyd do chất này phản ứng với các amin chính của protein (N-termina) amino acid và nhóm ε-amino của lysin tồn dư).
Phương pháp tiến hành:
Pha loãng mẫu thử bằng nước muối sinh lý (TT) đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn. Điều chỉnh pH từ 8 đến 10,5 trước khi thêm thuốc thử phthaldehyd.
Pha dung dịch chuẩn bằng nước muối sinh lý (TT) (không ít hơn 5 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng từ 10 μg/mlđến 200 μg/ml. Điều chỉnh pH từ 8 đến 10,5 trước khi thêm thuốc thử phthaldehyd.Dùng nước muối sinh lý (TT) làm mẫu trắng.
Trộn 10 ml các dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng với 0,1 ml thuốc thử phthaldehyd, để yên ở nhiệt độ phòng trong 15 min. Thêm 3 ml dung dịch natri hydroxyd 0,5 M và lắc đều. Đo cường độ huỳnh quang các dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử ở bước sóng kích thích 340 nm và bước sóng phát xạ giữa 440 nm và 445 nm.
Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.
Pha dung dịch đệm borat: Hòa tan 61,83 g acid boric trong nước cất và điều chỉnh pH 10,4 bằng dung dịch kali hydroxyd, thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều.
Pha dung dịch gốc phthaldehyd: Hòa tan 1,20 g o-phthaldehyd trong 1,5 ml methanol (TT), thêm 100 ml dung dịch đệm borat 0, 01 lắc đều. Thêm 0,6 ml dung dịch macrogol 23 lauryl ether và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng sử dụng trong 3 tuần.
Pha thuốc thử phthaldehyd: Thêm 15 μl 2-mercaptoethanol vào 5 ml dung dịch gốc phthaldehyd. Chuẩn bị dung dịch này trước khi dùng 30 min. Sử dụng trong vòng 24 h.
Tiêu chuẩn chấp thuận
Theo quy định trong chuyên luận riêng.
, thêm 100 ml dung dịch đệm borat 0, 01 lắc đều. Thêm 0,6 ml dung dịch macrogol 23 lauryl ether và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng sử dụng trong 3 tuần.){kind=link}