XÁC ĐỊNH HIỆU GIÁ HUYẾT THANH KHÁNG DẠI

phụ lục 15.17

Hiệu giá huyết thanh kháng dại được xác định dựa trên nguyên lý của phản ứng trung hòa in vivo của một liều cố định virus dại thử thách với các độ pha loãng khác nhau của huyết thanh kháng dại.

Xác định hiệu giá của virus thử thách

Chủng virus dại thử thách được dùng trong thử nghiệm xác định hiệu giá của huyết thanh kháng dại là chủng CVS (Challenge virus strain), được giữ ở dạng hỗn dịch 20 % não chuột, bảo quản ở nhiệt độ -70 °C.
Làm tan băng nhanh ống đựng chủng virus dại thử thách dưới vòi nước chảy.
Pha loãng bậc 10 với dung dịch huyết thanh ngựa thường 2 % (đã được bất hoạt 30 min ở 56 °C) để có nồng độ từ 2 X 10^-2, 2 X 10^-3 …. đến 2 X 10^-9.
Trong một dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 0,5 ml hỗn dịch virus của mỗi độ pha loãng, từ 2 x 10^-4 đến 2 X 10^-9 và 0,5 ml dung dịch huyết thanh ngựa thường 2 %.
Lắc đều các ống, để yên ở 37 °C trong 90 min. Tiêm 0,03 ml vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột cho mỗi độ pha, cân nặng mỗi chuột từ 14 g đến 16 g. Các ống chủng được giữ trong nước đá trong suốt quá trình tiêm.
Theo dõi và ghi chép số chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.
Tính LD₅₀ theo spearman – Karber.

Xác định hiệu giá huyết thanh kháng dại

Pha loãng huyết thanh kháng dại chuẩn quốc tế, huyết thanh kháng dại thử nghiệm virus trung hòa với virus thử thách:
Pha huyết thanh kháng dại chuẩn quốc tế với nước muối sinh lý để có dung dịch huyết thanh kháng dại chuẩn chứa 10 đơn vị quốc tế (IU)/ml.
Pha huyết thanh kháng dại thử nghiệm với nước muối sinh lý để có dung dịch huyết thanh kháng dại thử nghiệm chứa khoảng 10 IU/ml. Pha loãng bậc 5 hai dung dịch trên với dung dịch huyết thanh ngựa thường 2 % để có các độ pha 1/5; 1/25; 1/125; 1/625 và 1/3125.
Pha hỗn dịch virus thử thách đã biết hiệu giá để có 200 LD₅₀/0,03 ml.
Trong một dãy các ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 0,5 ml huyết thanh kháng dại ở mỗi độ pha loãng và 0,5 ml hỗn dịch virus thử thách có chứa 200 LD50/0,03 ml.
Lắc đều các ống nghiệm và để yên ở 37 °C trong 90 min.
Giữ các ống trong nước đá trong suốt quá trình tiêm.
Tiêm 0,03 ml vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột có cân nặng từ 14 g đến 16 g cho mỗi độ pha của kháng huyết thanh.
Theo dõi và ghi chép số chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.
Xác định số LD₅₀ của chủng virus dại trong thử nghiệm (nhóm chứng):
Từ hỗn dịch virus pha để trung hòa có chứa 200 LD₅₀/0,03 ml đã nêu ở trên, được xem là 10° để từ đó pha loãng bậc 10 thành 3 độ pha 10^-1; 10^-2 và 10^-3.
Trong một dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 0,5 ml hỗn dịch virus từ mỗi độ pha và 0,5 ml dung dịch huyết thanh ngựa thường 2 %.
Lắc đều các ống nghiệm và để yên ở 37 °C trong 90 min.
Giữ các ống trong nước đá.
Tiêm 0,03 ml vào não của mỗi chuột nhắt, dùng 6 chuột có cân nặng từ 14 g đến 16 g cho mỗi độ pha của hỗn dịch virus dại.
Theo dõi và ghi chép sổ chuột bị chết từ ngày thứ 6 đến ngày thứ 20 sau khi tiêm.
Tính LD₅₀ theo bảng spearman – Karber.

Tính kết quả

Thử nghiệm chỉ có giá trị khi số LD50 để trung hòa huyết thanh kháng dại là 100 LD₅₀ đến 300 LD₅₀ trong 0,03 ml.
Tính ED₅₀ của huyết thanh kháng dại theo phương pháp spearman – Karber.
Hiệu giá của huyết thanh kháng dại được tính ra đơn vị quốc tế trong 1 ml và bằng:
Antilog(ED_{50 h}uyết thanh chuẩn quốc tế: ED₅₀ huyết thanh thử nghiệm) X 2 X N
Trong đó:
2 là số IU có trong 1 ml huyết thanh kháng dại chuẩn quốc tế dùng trong thử nghiệm;
N là số lần pha loãng huyết thanh kháng dại thử nghiệm.