ĐỒ ĐỰNG BẰNG CHẤT DẺO DÙNG CHO CHẾ PHẨM THUỐC TIÊM

PHỤ LỤC 17.3.2

Yêu cầu chung

Nguyên liệu

Chỉ những chất dẻo tinh khiết, không màu, không mùi, mới được dùng làm nguyên liệu để chế tạo đồ đựng thuốc tiêm. Đồ đựng thuốc tiêm có thể được chế tạo từ một hay nhiều polymer như polyethylen, polypropylen, polyvinyl clorid và có thể thêm các chất phụ gia để chống oxy hóa, làm trơn, hóa dẻo, ổn định nhưng không được dùng các chất để tạo màu.

Đặc tính

Đồ đựng phải đủ trong để kiểm tra được bằng mắt thường thuốc chứa bên trong. Đồ đựng đã đóng thuốc phải chịu được phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt hoặc các phương pháp tiệt khuẩn khác. Sau khi tiệt khuẩn, đồ đựng không được có dấu hiệu bị co lại, méo mó, biến màu, mất độ trong, rạn nứt, chảy dính hoặc bất kỳ sự hư hỏng nào khác.
Đồ đựng phải không cho vi sinh vật thâm nhập vào thuốc sau khi đã hàn kín. Đồ đựng có thể là túi hoặc chai có kích thước, hình dáng thích hợp cho việc sử dụng (có thể thêm các nút gan, dây treo khi tiêm truyền).

Thử nghiệm về tính chất của đồ đựng

Thử độ kín, độ gấp non

Phải đáp ứng những thử nghiệm trong chuyên luận Đồ đựng chất dẻo cho những chế phẩm không phải thuốc tiêm (Phụ lục 17.3.1).

Độ trong của đồ đựng

Hỗn dịch chuẩn: Hòa tan 1,0 g hydrazin Sulfat (TT) trong một ít nước, thêm nước vừa đủ 100 ml, để yên trong 6 h. Thêm 25,0 ml dung dịch hexamin 10 % (TT) vào 25 ml dung dịch này, trộn kỹ và để yên trong 24 h. Hỗn dịch thu được bền trong khoảng 2 tháng. Pha loãng 15 ml hỗn dịch này với nước vừa đủ 1000 ml. Hỗn dịch chuẩn chỉ dùng trong vòng 24 h.
Pha loãng hỗn dịch chuẩn để thu được hỗn dịch có độ hấp thụ ở bước sóng khoảng 640 nm là 0,37 đến 0,43 (pha loãng khoảng 16 lần). Cho một thể tích hỗn dịch thu được bằng dung tích qui định vào 5 đồ đựng. Độ đục của hỗn dịch khi nhìn qua đồ đựng phải đục hơn so với nước cất đựng trong đồ đựng tương ứng.

Độ ngấm hơi nước

Cho nước vào 5 đồ đựng theo dung tích qui định và hàn kín bằng một miếng polyethylen, nhôm mỏng hay một cách khác thích hợp. Cân chính xác mỗi đồ đựng và để yên (không phủ gì ở trên) trong 14 ngày ở độ ẩm tương đối 60 % ± 5 % và ở nhiệt độ trong khoảng 20 °C đến 25 °C. Cân lại các đồ đựng. Khối lượng giảm đi không được vượt quá 0,2 %.

Những đồ đựng bằng chất dẻo polyvinyl clorid (PVC) dùng cho thuốc tiêm (tiêm truyền tĩnh mạch) phải đạt thêm những phép thử sau:

Chất di(2-ethylhexyl)phthalat chiết được: Không quá 0,010 %(kl/tt). Dùng một ống cấp, kim hoặc bộ phận nối thích hợp. Cho vào đồ đựng một thể tích dung môi chiết bằng khoảng một nửa dung tích. Hút hết không khí ra và hàn kín ống cấp. Đặt đồ đựng theo hướng nằm ngang vào một nồi cách thủy và giữ nhiệt độ ở 36 °C đến 38 °C trong 60 min ± 1 min, không lắc. Lấy đồ dựng ra khỏi nồi cách thủy, đảo ngược đồ đựng cẩn thận 10 lần và chuyển dịch chứa ở trong sang một bình thủy tinh. Do ngay độ hấp thụ ở cực đại khoảng 272 nm (Phụ lục 4.1). Tính phần trăm của di(2-ethylhexyl) phthalat theo đường chuẩn.
Dung môi chiết: Ethanol đã pha loãng để có tỷ trọng tương đối từ 0,9373 đến 0,9378 và làm ấm tới 37 °C trong một bình có nút kín. Đường chuẩn di(2-ethylhexyl) phthalat: Pha 5 dung dịch chuẩn có chứa 0,020 %; 0,010 %; 0,0050 %; 0.0020 %; 0,0010 % (kl/tt) di(2-ethylhexyl) phthalat trong dung môi chiết. Đo độ hấp thụ trong cùng điều kiện.

Thử nghiệm về chất liệu của đồ đựng

Dùng phần đồ đựng không có nhãn, không có vết in hoặc không bị dát mỏng hoặc hạt chất dẻo trong trường hợp đồ đựng được chế tạo đồng thời với quá trình đóng thuốc và hàn kín.

Bari

Làm ẩm 2 g mẫu thử với acid hydrocloric (TT) và nung trong một chén bạch kim. Hòa tan tro trong 10 ml dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT), lọc và thêm 1 ml dung dịch acid sulfuric 1 M (TT) vào dịch lọc. Độ đục không lớn hơn hỗn dịch đục chuẩn thu được bằng cách cho 1 ml dung dịch acid sulfuric 1 M (TT) vào mỗi hỗn hợp 10 ml dung dịch bari chuẩn (10 phần triệu Ba) và 10 ml dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT).

Kim loại nặng

Cho 2,5 g mẫu thử vào một bình đáy tròn, cổ dài, thêm 20 ml acid sulfuric (TT) và đốt thành than trong khoảng 10 min. Thêm từng giọt nước oxy già (100 thể tích) vào dung dịch nóng cho tới khi hết màu, đun nóng sau mỗi lần thêm cho tới khi có khói trắng bay lên. Để nguội, dùng 10 ml nước cất để chuyển hết cắn từ bình sang đĩa bạch kim và bốc hơi đến khô. Hòa tan cắn vào 10 ml dung dịch acid hydrocloric 1 M (TT). Lọc nếu cần, thêm nước để được 25 ml (dung dịch A). Thêm 1,2 ml dung dịch thioacetamid (TT) vào hỗn hợp gồm 10 ml dung dịch A và 2 ml đệm acetat pH 3,5 (TT), lắc trộn đều ngay và để yên trong 2 min. Nếu dung dịch tạo thành có màu vàng, màu phải không được đậm hơn màu vàng thu được bằng cách đun 10 ml dung dịch cadmi mẫu 10 phần triệu Cd (TT) thay cho dung dịch A. Nếu là màu nâu phải không được đậm hơn màu nâu thu được bằng cách dùng một hỗn hợp 5 ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb (TT) và 5 ml nước thay cho dung dịch A.

Thiếc

Thêm 5 ml dung dịch acid sulfuric 20 % (TT), 1 ml dung dịch natri dodecyl sulfat 1 % (kl/tt) và 1 ml thuốc thử kẽm dithiol (TT) vào 10 ml dung dịch A trong phép thử kim loại nặng. Đun nóng trong nồi cách thủy đúng 1 min. Làm nguội và để yên trong 30 min. Nếu dung dịch tạo thành có màu đỏ thì không được đậm hơn màu đỏ thu được bằng cách dùng 10 ml dung dịch thiếc mẫu 5 phần triệu Sn (TT) thay cho dung dịch A.

Kẽm

Lấy 1 ml dung dịch A trong phép thử kim loại nặng, thêm nước cất vừa đủ 100 ml. Lấy 10 ml dung dịch thu được, thêm 5 ml dung dịch đệm acetat pH 4,4 (TT) và 1 ml dung dịch natri thiosulfat 0,1 M (TT), 5 ml dung dịch dithizon 0,001 % trong cloroform (TT). Lắc và để yên 2 min. Màu tím trong lớp cloroform không được đậm hơn màu thu được bằng cách dùng hỗn hợp 2 ml dung dịch kẽm màu 10 phần triệu Zn (TT) và 8 ml nước thay cho dung dịch thử.
Tiến hành một mẫu trắng kiểm tra, dùng 10 ml nước thay cho 10 ml dung dịch thử. Thử nghiệm không có giá trị nếu lớp cloroform thu được trong mẫu trắng có màu xanh lục.

Cấn nung

Lấy 5 g đồ đựng đã cắt nhỏ cho vào một chén nung thích hợp đã cân bì. Nung ở  800 °C± 2 5 °C tới khối lượng không đổi. Đổ chén nung cho nguội trong bình hút ẩm sau mỗi lần nung, lượng cấn không được quá 0,1 %.

Thử nghiệm trên dịch chiết

Thử nghiệm hóa lý

Những thử nghiệm sau đây thực hiện trên dịch chiết từ đồ đựng là chất dẻo, lượng chất dẻo tính theo diện tích bề mặt (cả 2 mặt) và chiết ở nhiệt độ qui định. Mẫu chất dẻo đồng nhất về chất liệu được cắt thành những miếng dài khoảng 5 cm và rộng khoảng 0,3 cm. Chuyển mẫu đã chia nhỏ vào một bình thủy tinh hình trụ dung tích 250 ml có nút mài, thêm khoảng 150 ml nước. Lắc khoảng 30 s, gạn bỏ nước và rửa lại một lần nữa. Cho vào bình chiết thích hợp một lượng mẫu đã chuẩn bị có diện tích bề mặt khoảng 1200 cm² nếu bề dày của mẫu là 0,5 mm hoặc mỏng hơn, hoặc 600 cm² nếu bề dày lớn hơn 0,5 mm. Thêm 200 ml nước và chiết nóng trong nồi cách thủy ở 70 °C trong 24 h hoặc trong nồi hấp ở 120 °C trong 30 min. Làm nguội nhưng không dưới 20 °C. Lấy 20,0 ml dịch chiết vào một bình thích hợp để dùng cho phép thử dung lượng đệm. Gạn ngay dịch chiết còn lại vào một bình sạch và đậy kín để thử các phép thử dưới đây. Dùng nước để làm mẫu trắng trong những phép thử sau:
Độ trong và màu sắc: Dịch chiết phải trong (Phụ lục 9.2) và không màu (Phụ lục 9.3).
Độ hấp thụ ánh sáng: Lọc dịch chiết nếu cắn và dịch lọc có độ hấp thụ ánh sáng không quá 0,08 ở 220 nm đến 240 nm và không quá 0,05 ở 240 nm đến 360 nm (Phụ lục 4. 1). Dùng nước để làm mẫu trắng.
pH: Cứ mỗi 20 ml dịch chiết và mẫu trắng cho thêm 1 ml dung dịch kali clorid 0,1 % (TT), xác định pH của dung dịch (Phụ lục 6.2). Hiệu số pH của hai dung dịch không được lớn hơn 1,5.
Chất không bay hơi: Cho 50,0 ml dịch chiết vào một chén nung thích hợp đã cân bì và được làm sạch bằng acid. Bốc hơi trên cách thủy cho tới khô và sấy cắn ở 105 °C trong 1 h, Song song làm mẫu trắng. Hiệu số giữa cắn của dịch chiết và mẫu trắng không được vượt quá 15 mg.
Ghi chú: Nếu là cắn dầu thì kiểm tra lại quá trình bay hơi, giai đoạn làm khô, và giảm nhiệt nếu dầu có xu hướng bám vào thành của chén nung.
Cắn nung (Không cần phải làm thử nghiệm này nếu kết quả thử nghiệm cắn không bay hơi không vượt quá 5 mg): Tiến hành với chất không bay hơi thu được từ mẫu thử và mẫu trắng, nhưng cho thêm cùng một lượng acid sulfuric (TT) vào mỗi chén nung. Hiệu số giữa cắn nung của mẫu thử và mẫu trắng không vượt quá 5 mg.
Kim loại nặng: Dịch chiết có thể lọc nếu cắn. lấy 20.0 ml cho vào 1 trong 2 ống Nessier, điều chỉnh pH tới khoảng giữa 3,0 và 4,0 với dung dịch acid acetic 1 M (TT) hay dung dịch amoniac 5 M (TT), pha loãng với nước để thành 35 ml và trộn đều. Cho vào ống Nessler kia 2,0 ml dung dịch chì mẫu 1 phần triệu Pb (TT) và 20 ml nước. Điều chỉnh pH vào khoảng giữa 3,0 và 4,0 với dung dịch acid acetic 1 M (TT) hay dung dịch amoniac 5 M (TT). Pha loãng với nước để thành 35 ml và trộn đều.
Cho vào mỗi ống 10 ml dung dịch dihydmsuifid (TT) vừa mới pha, thêm nước thành 50 ml và trộn đều. Trong 10 min, nếu dịch chiết có màu nâu thì không được đậm hơn màu trong ống chuẩn.
Dung lượng đệm: Lấy 20 ml dịch chiết đem chuẩn độ với dung dịch acid hydrocloric 0,01 M (CĐ) hay dung dịch natri hydroxyd 0,01 M (CĐ) tới pH 7,0 xác định bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế (Phụ lục 10.2). Song song chuẩn độ với 20 ml mẫu trắng. Nếu mẫu thử và mẫu trắng dùng cùng loại dung dịch chuẩn độ thì hiệu của hai thể tích đã dùng ở trên không vượt quá 10,0 ml, nếu dùng hai dung dịch chuẩn độ khác loại cho mẫu thử hay mẫu trắng thì tổng số thể tích không lớn hơn 10,0 ml.
Những chất bị oxy hóa: Cho 20,0 ml dịch chiết vào một bình thủy tinh nút mài, thêm 20,0 ml dung dịch kali pemanganat 0,002 M (CĐ) và 1 ml dung dịch acid sulfuric 10 % (kl/kl), đun sôi 3 min. Để nguội, thêm 0,1 g kali iodid (TT), lắc trộn đều và để yên 10 min trong tối. Chuẩn độ bằng dung dịch natri thiosulfat 0,01 M (CĐ). Dùng 0,25 ml dung dịch hồ tinh bột (TT) cho vào khoảng cuối chuẩn độ làm chỉ thị màu. Song song làm mẫu trắng, hiệu số giữa hai lần định lượng không khác nhau quá 1,0 ml.

Thử nghiệm sinh học

Những thử nghiệm sau đây được xây dựng để đánh giá đáp ứng sinh học của động vật đối với những vật liệu là chất dẻo hay polymer khác khi tiêm các chất chiết từ mẫu thử nghiệm.
Lượng mẫu thử được lấy theo diện tích bề mặt đem chiết. Khi diện tích bề mặt không thể xác định được thì dùng 0.2 g mẫu thử cho mỗi túi dịch chiết, cần thận trọng khi chuẩn bị các mẫu thử để tiêm, tránh nhiễm khuẩn và các chất lạ.
Thử nghiệm áp dụng cho các loại chất dẻo và các polymer đúng với điều kiện sử dụng. Khi các đồ đựng phải rửa hoặc tiệt khuẩn trước khi dùng thì thử nghiệm cũng phải tiến hành trên mẫu đồ dựng đã được xử lý với cùng qui trình rửa và tiệt khuẩn.
Mẫu thử là dịch chiết từ mẫu đồ đựng cần thử. Mẫu trắng là dung môi dùng để chiết được xử lý trong cùng điều kiện và qui trình như mẫu thứ. Mẫu đối chiếu âm tính là mẫu không cho phản ứng trong cùng điều kiện thử.

a) Thử nghiệm toàn thân

Thử nghiệm dùng để đánh giá đáp ứng toàn thân của chuột nhắt sau khi tiêm dịch chiết từ mẫu cần thử.
Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng khỏe mạnh, cùng nguồn gốc. cân nặng 18 g đến 22 g. chưa dùng vào thí nghiệm nào trước đó. Chuột được cho ăn và uống nước bình thường.

Dụng cụ:
Nồi hấp có khả năng duy trì nhiệt độ ở 121 °C ± 2 °C, có thêm hệ thống nước làm lạnh để làm nguội bình đựng mẫu thử đèn khoảng 20°C ngay sau khi hấp. Tủ sấy có khả năng duy trì nhiệt độ ở 50 °C ± 2 °C hoặc 70 °C ± 2 °C. Dùng ống nghiệm hoặc ống nuôi cấy có nắp xoáy là thủy tinh trung tính (thủy tinh loại để chiết mẫu).
Chuẩn bị dụng cụ:
Các dụng cụ thủy tinh cần tráng bằng hỗn hợp acid cromic hoặc acid nitric nóng, súc rửa kỹ với nước, tráng lại bằng nước cất. Rửa các dụng cụ để cắt lần lượt với aceton và dicloromethan trước khi dùng để cắt mẫu. Tất cả các dụng cụ khác phải được rửa với chất tẩy rửa thích hợp rồi tráng kỹ bằng nước cất. Làm khô và tiệt khuẩn các dụng cụ bằng phương pháp thích hợp.
Dung môi chiết: Việc lựa chọn dung môi chiết, trong số các dung môi chiết dưới đây, cần đại diện cho thành phần dung môi có trong chế phẩm sẽ tiếp xúc trực tiếp với đồ đựng chất dẻo đem thử nghiệm.
Dung dịch tiêm natri clorid 0,9 % (vô khuẩn và không có chất gây sốt).
Dung dịch 5 % của ethanol trong dung dịch tiêm natri clorid 0,9 %
Polyethylen glycol 400.
Dầu thực vật: Dùng dầu vừng, dầu lạc hoặc dầu hạt bông mới tinh chế và phải đạt thêm các yêu cầu sau: Dùng 3 thỏ thí nghiệm theo qui định phép thử tiêm trong da. Tiêm trong da 0,2 ml vào mỗi điểm, tiêm 10 điểm trên mỗi thỏ. Quan sát chỗ tiêm 24 h, 48 h và 72 h sau khi tiêm. Không được có điểm nào có phản ứng dưới dạng vết đỏ hay phồng có đường kính lớn hơn 0,5 cm.
Chuẩn bị mẫu thử:
Chọn và cắt mẫu thử thành những mảnh nhỏ theo kích thước hướng dẫn trong Bảng 17.3.2.1. Loại bỏ những vật lạ như xơ vải và những mảnh vụn quá nhỏ bằng cách cho mẫu đã cất vào ống đong thủy tinh loại I, dung tích 100 ml, có nút mài, thêm 70 ml nước để pha thuốc tiêm. Lắc trong khoảng 30 s, gạn bỏ hết nước, làm lại một lần nữa. Với phần mẫu dùng chiết bằng dung môi là dầu thực vật, cần sấy khô mẫu thử ở nhiệt độ không quá 50 °C.
Ghi chú: Không lau mẫu bằng khăn khô/ẩm hoặc rửa bằng dung môi hữu cơ.
Chuẩn bị dịch chiết: Cho lượng mẫu thử đã xử lý đúng yêu cầu vào dụng cụ chiết, thêm 20 ml dung môi chiết, Chuẩn bị như vậy với từng loại dung môi chiết theo yêu cầu phép thử. Song song chuẩn bị một mẫu trắng dùng 20 ml cho mỗi loại dung môi và xử lý trong cùng điều kiện. Chiết bằng cách hấp trong nồi hấp ở 120 °C trong 60 min hoặc trong tủ ấm ở 70°C trong 24 h hoặc ở 50 °C trong 72 h, tùy thuộc vào loại chất dẻo đem thử.
Làm nguội ngay đến nhiệt độ phòng nhưng không dưới 20 °C. lắc mạnh trong vài phút và gạn ngay mỗi dịch chiết vào một bình khô, vô khuẩn. Bảo quản các dịch chiết ở nhiệt độ từ 20 °C đến 30 °C nhưng không dùng để thử nếu để quá 24 h.

Ghi chú: Điều kiện chiết không được làm thay đổi trạng thái vật lý của mẫu thử, như làm chảy hoặc làm nóng chảy mẫu thử, dẫn tới làm giảm diện tích bề mặt mẫu thử. Có thể cho phép các mảnh dính nhẹ vào nhau. Nên cho từng mảnh nhỏ đã rửa sạch vào dung môi chiết. Nếu dùng các ống nuôi cấy để chiết với dầu thực vật trong nồi hấp thì phải dán kín mép quanh nút với băng dính tốt để ngăn hơi nước không vào trong dịch chiết.
Tiến hành:
Lắc mạnh dịch chiết trước mỗi liều tiêm để đảm bảo chất chiết được phân bố đều. Chú ý không lấy các tiểu phân nhìn thấy được để tiêm tĩnh mạch. Dùng 5 chuột cho một nhóm, mỗi nhóm thử với một dịch chiết của mẫu thử hoặc mẫu trắng, Liều tiêm và đường tiêm theo hướng dẫn ở Bảng 17.3.2.2. Riêng dịch chiết với dung môi polyethylen glycol và mẫu trắng tương ứng cần pha loãng với 4.1 thể tích dung dịch tiêm natri clorid 0,9 % để được dung dịch có nồng độ khoảng 200 mg polyethylen glycol trong 1 ml.

Quan sát tất cả các chuột ngay sau khi tiêm, sau 4 h và ít nhất vào các thời điểm 24 h, 28 h và 72 h sau khi tiêm. Nếu trong thời gian theo dõi không có chuột nào của nhóm tiêm mẫu thử có phản ứng sinh học lớn hơn đáng kể so với nhóm tiêm mẫu trắng thì mẫu thử đạt yêu cầu. Nếu có 2 chuột hoặc nhiều hơn bị chết hoặc có 2 chuột hoặc nhiều hơn có biểu hiện bất thường như co giật, suy nhược hoặc có 3 chuột trở lên bị giảm cân (> 2 g) thì mẫu thử không đạt yêu cầu.
Nếu có một chuột bị chết hoặc có dấu hiệu phản ứng sinh học thì thử lại trên 10 chuột khác. Với lần thử lại, mẫu thử đạt yêu cầu nếu tất cả 10 chuột đều sống và không có biểu hiện sinh học khác nhau đáng kể so với nhóm chứng.

b) Thử nghiệm tiêm trong da

Thử nghiệm này được xây dựng để đánh giá phản ứng tại chỗ của thỏ với dịch chiết mẫu thử sau khi tiêm vào trong da.
Động vật thí nghiệm: Chọn thỏ trắng, da mỏng, có thể cắt lông thật ngắn và da không bị tổn thương hoặc bị kích ứng do cọ xát. Trong thời gian theo dõi, tránh tiếp xúc vào những chỗ tiêm trừ khi cần phân biệt giữa nốt phù nề với vết dầu đọng.
Ghi chú: Những thỏ trước đó đã dùng cho các phép thử không liên quan như thử chất gây sốt hoặc thỏ đã nghỉ một thời gian sau lần thử trước, có thể dùng vào phép thử này nếu da sạch và không bị tổn thương.
Tiến hành: Trong ngày thí nghiệm, cắt lông trên phần lưng thỏ, về cả hai bên sống lưng, một khoảng đủ rộng để thử. Tránh gây kích ứng và làm tổn thương da. Dùng máy hút để loại hết lỏng rơi ra, khi cần có thể lau nhẹ da bằng ethanol loãng và để khô trước khi tiêm. Mỗi loại dịch chiết cần thử trên 2 thỏ, một bên tiêm dịch chiết và một bên tiêm mẫu trắng theo hướng dẫn trong Bảng 17.3.2.3. Để tránh lãng phí, trên cùng một thỏ có thể tiêm một vài loại dịch chiết hoặc dịch chiết của vài mẫu khác nếu kết quả không ảnh hưởng lẫn nhau. Lắc mạnh mỗi dịch chiết trước khi lấy để tiêm. Mẫu dịch chiết với polyethylen glycol 400 và mẫu trắng tương ứng, cần pha loãng với dung dịch tiêm natri clorid 0,9 % để có nồng độ polyethylen glycol khoảng 120 mg trong 1 ml.

Quan sát các chỗ tiêm để phát hiện các phản ứng của mô như ban đỏ, phù nề hoặc hoại tử. Có thể lau nhẹ bằng ethanol loãng để dễ quan sát và đánh giá kết quả. Quan sát tất cả các thỏ thí nghiệm tại các thời điểm 24 h, 48 h và 72 h sau khi tiêm. Chấm điểm tất cả các chỗ tiêm của mẫu trắng và mẫu thử theo thang điểm qui định trong Bảng 17.3.2.4.

Trong thời gian theo dõi, nếu cần có thể cắt lại lông thỏ để dễ quan sát. Tính điểm ban đỏ và phù nề trung bình cho mẫu trắng và mẫu thử ở mỗi lần chấm điểm (24 h, 28 h và 72 h) cho mỗi thỏ. Sau 72 h, cộng tất cả các điểm ban đỏ và phù nề cho riêng mẫu thử và mẫu trắng, Chia tổng số điểm của từng mẫu cho 12 (2 thỏ X 3 lần ghi điểm X 2 lần ghi loại điểm) để xác định điểm trung bình chung với mỗi mẫu thử và mẫu trắng tương ứng. Phép thử đạt yêu cầu nếu hiệu số giữa điểm trung bình của mẫu thử và mẫu trắng tương ứng nhỏ hơn hoặc bằng 1. Nếu ở bất kỳ lần ghi điểm nào đó, điểm phản ứng trung bình của mẫu thử nghi ngờ cao hơn mẫu trắng, làm lại thêm trên 3 thỏ khác. Phép thử đạt yêu cầu nếu điểm trung bình giữa mẫu thử và mẫu trắng khác nhau nhỏ hơn hoặc bằng 1,0.

c) Thử nghiệm chất gây sốt

Thử nghiệm này được qui định cho các đồ đựng bằng chất dẻo dùng cho thuốc tiêm truyền. Dùng dung môi chiết là dung dịch tiêm natri clorid 0,9 % không có chất gây sốt. Chuẩn bị mẫu thử và dịch chiết như hướng dẫn trong phép thử tiêm toàn thân. Các dụng cụ chiết phải đảm bảo không có chất gây sốt.
Tiến hành theo thử nghiệm chất gây sốt (Phụ lục 13.4), tiêm 10 ml dịch chiết cho 1 kg thỏ.