XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VI POLYSACCHARID CỦA VẮC XIN THƯƠNG HÀN VI POLYSACCHARID

0
444

PHỤ LỤC 15.37

Nguyên lý

Sử dụng phản ứng điện di miễn dịch rocket để xác định hàm lượng Vi polysaccharid trong vắc xin thương hàn Vi.

Phương pháp tiến hành

Pha dung dịch đệm và thạch agarose

Dung dịch đệm Barbital 1/2 : Dùng ống đong 500 ml đong 200 ml nước cất 3 lần cho vào chai thủy tinh loại 1000 ml, thêm 1,84 g acid bachituric vào chai thủy tinh, đun trong cách thuỷ và lắc đều cho đến khi hoà tan hoàn toàn. Để nguội đến nhiệt độ phòng. Thêm tiếp 10,3 g natri barbital vào chai thủy tinh, lắc cho tan. Chuyển dung dịch thu được vào bình định mức 500 ml, thêm nước cất 3 lần vừa đủ đến vạch, lắc đều. Điều chỉnh đến pH 8,6 bằng dung dịch acid hydrocloric. 0,1 M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 5 M (TT).
Bảo quản dung dịch thu được ở nhiệt độ phòng, trong chai có nút vặn kín. Sử dụng trong thời gian không quá 30 ngày kể từ ngày pha chế.
Rót dung dịch đệm barbital Vi vào bể điện di.
Thạch agarose: Thêm 0,5 g thạch agarose vào 40 ml dung dịch đệm barbital 1/2 , đun cách thuỷ hoặc đun trên máy khuấy từ gia nhiệt cho đến khi thạch tan chảy hoàn toàn. Để thạch nguội đến khoảng 56 °C, cho 1 ml huyết thanh thỏ kháng Vi vào và lắc nhẹ tròn đều chai thạch sao cho huyết thanh thỏ kháng Vi hoà tan đều vào thạch nhưng không bị tạo bọt.

Tạo bản gel và đục lỗ thạch

Đổ thạch trên khuôn, chờ thạch nguội hoàn toàn.
Đục lỗ thạch bằng bộ đục lỗ chuyên dụng sao cho các giếng trên bản gel phải cách mép bản gel ít nhất 2 cm và cách nhau ít nhất 1 cm. Số lượng giếng trên bản gel phải được tính toán sao cho có đủ 5 giếng cho các hàm lượng kháng nguyên Vi chuẩn, 2 giếng (làm kép) cho mỗi mẫu thử.

Pha mẫu kháng nguyên Vi chuẩn

Pha loãng kháng nguyên Vi chuẩn bằng dung dịch PBS ở các độ pha loãng như sau: 100 μg; 50 μg; 25 μg; 12,5 μg;6,25 μg Vi polysaccharid /ml.
Lần lượt nhỏ mẫu chuẩn ở các độ pha loãng như trên vào từng giếng trên bản gel (5 μl/giếng); cho vào 2 giếng tiếp theo mỗi giếng 5 μl vắc xin mẫu thử.

Chạy điện di miễn dịch Rocket

Đặt bản gel vào máy điện di theo hướng mẫu đi từ cực âm sang cực dương.
Bật nguồn, cài đặt các thông số thích hợp về hiệu điện thế, cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di của mẫu.
Dùng giấy lọc Whatman làm cầu nối từ bể dung dịch điện di tới bản gel ở cả 2 đầu bản gel.
Bấm nút ”Run” để chạy điện di.

Rửa bản gel

Sau khi chạy điện di xong, tắt nguồn, lấy bản gel ra khỏi máy điện di, cho vào hộp nhựa trong có nắp kín.
Cho nước muối sinh lý ngập bản gel và ngâm, lẳc nhẹ bằng máy lắc trong 3 h (thay nước muối sinh lý 1 h/lần).
Hút hết nước muối sinh lý ra và thay bằng nước cất. Ngâm và lắc hộp nước cất có chứa bản gel liên tục. Sau khi ngâm được 1 h, thay nước cất 30 min/lần.

Ủ bản gel

Đổ toàn bộ nước cất ra khỏi hộp.
Phủ một lớp giấy lọc lên mặt bản gel để tránh cho bản gel không bị khô không đồng đều.
ủ bản gel qua đêm trong tủ ấm 37 °C.

Nhuộm và tẩy bản gel

Bóc bỏ lớp giấy lọc trên mặt bản gel.
Nhuộm bản gel bằng dung dịch nhuộm màu trong 15 min.Trong quá trình nhuộm, lắc đều hộp dung dịch nhuộm màu có chứa bản gel bằng máy lắc.
Hút bỏ toàn bộ dung dịch nhuộm màu và bơm dung dịch tẩy màu vào hộp chứa bản gel; ngâm, lắc liên tục cho đến khi nhìn rõ những cột tên lửa trên bàn gel. Nếu bản gel vẫn còn xanh đậm, có thể thay dung dịch tẩy màu mới nhằm rút ngắn thời gian tẩy màu của bản gel.

Đọc và tính kết quả

Bản gel được đưa ra khỏi hộp nhựa và đặt trên phiến kính trong.
Dùng thước đo chuyên dụng để đo chiều cao các cột tên lửa trên bàn gel, từ các giếng kháng nguyên chuẩn và mẫu thử.
Dựa vào chiều cao các cột tên lửa, xây dựng được đường chuẩn và tính kết quả hàm lượng kháng nguyên Vi từ mẫu thử bằng chương trình Excel.

Đánh giá kết quả

Loạt vắc xin thương hàn Vi polysaccharid được coi là đạt yêu cầu về chỉ số hàm lượng Vi polysaccharid khi thử nghiệm có giá trị (valid) và đạt 35 μg đến 65 μg polysaccharid 1,0 ml vắc xin.
Nếu thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysaccharid không có giá trị (invalid) vì một lý do nào đó thì phải nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu bằng lượng mẫu của lần kiểm tra thứ nhất.
Nếu thử nghiệm xác định hàm lượng Vi polysaccharid có giá trị (valid) nhưng không đạt yêu cầu về hàm lượng như quy định thì nhắc lại thử nghiệm với số lượng mẫu gấp đôi.
Ở lần kiểm tra thứ hai nếu hàm lượng Vi polysaccharid đạt yêu cầu (nằm trong khoảng cho phép của tiêu chuẩn chấp thuận thì loạt vắc xin đó được coi là đạt yêu cầu về hàm lượng Vi polysaccharid. Nếu kết quả hàm lượng Vi polysaccharid không đạt yêu cầu thì loạt vắc xin đó phải huỷ bỏ, không được phép xuất xưởng đưa vào sử dụng.

Tiêu chuẩn chấp thuận

(25 μg ± 30 %) Vi polysaccharid/ liều đơn vắc xin dùng cho người (0,5 ml).

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VI POLYSACCHARID CỦA VẮC XIN THƯƠNG HÀN VI POLYSACCHARID
Rate this post

LEAVE A REPLY

Please enter your comment!
Please enter your name here