HUYẾT THANH KHÁNG NỌC RẮN (Immunoserum contra venena) – Dược điển Việt Nam 5

Huyết thanh kháng nọc rắn là chế phẩm chứa các globulin miễn dịch kháng nọc rắn có khả năng trung hòa đặc hiệu nọc rắn tương ứng. Huyết thanh kháng nọc rắn ở dạng lỏng là dung dịch không màu, trong suốt hoặc có màu vàng nhạt, hơi nhớt. Huyết thanh kháng nọc rắn có thể ở dạng đông khô kèm theo nước hồi chỉnh. Huyết thanh kháng nọc rắn được chỉ định dùng để điều trị bệnh nhân bị rắn cắn.

Sản xuất

Huyết thanh kháng nọc rắn được tinh chế sản xuất từ huyết tương ngựa khỏe mạnh, tuổi từ 4 năm đến 7 năm, cân nặng từ 200 kg trở lên, ngựa đực phải thiến, ngựa cái không được sinh sản, đã được miễn dịch với kháng nguyên nọc rắn. Huyết thanh kháng nọc rắn được tinh chế, cô đặc bằng phương pháp Pope dùng pepsin, có chất bảo quản là merthiolat 1/10000. Sau đó được lọc vô trùng qua màng lọc 0,2 mcm, pha chế đến hàm lượng thích hợp và đóng ống.

Nhận dạng

Huyết thanh kháng nọc rắn được nhận dạng thông qua thử nghiệm xác định hiệu giá.

Hiệu giá

Thử nghiệm xác định hiệu giá của huyết thanh kháng nọc rắn được thực hiện trên nguyên lý trung hòa nọc rắn với huyết thanh kháng nọc rắn tương ứng. Thử nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng Swiss để xác định số LD₅₀ có trong 1 ml huyết thanh.

Xem thêm: GLOBULIN MIỄN DỊCH NGƯỜI (Immunoglobulinum humanum normale) – Dược điển Việt Nam 5

Phương pháp tiến hành

Vật liệu:
Huyết thanh kháng nọc rắn thử nghiệm.

Nọc rắn tinh chế.
Chuột nhắt trắng Swiss, cân nặng 18 g đến 20 g.

Nước muối sinh lý.
Tiến hành:
*Xác định LD₅₀ của nọc rắn:
Pha dung dịch nọc rắn gốc: Pha dung dịch nọc rắn gốc có nồng độ 1000 µg/ml bằng cách cân 10 mg nọc rắn và hòa tan trong 10,0 ml nước muối sinh lý (bảo quản trong tủ lạnh từ 2 – 8 °C).
Pha dung dịch nọc rắn thử nghiệm: Từ dung dịch nọc rắn gốc pha loãng bằng nước muối sinh lý để được dung dịch có nồng độ 250 µg/ml hoặc 500 µg/ml (tùy theo độc lực của nọc rắn).
Từ dung dịch nọc rắn thử nghiệm tiến hành pha loãng cách nhau 1,1 hoặc 1,4 lần thành các độ pha liên tiếp, sao cho sau khi tiêm độ pha loãng thấp nhất chuột phải chết 100 % và độ pha loãng cao nhất chuột phải sống 100 % (sau khi pha xong lắc đều và để ở 37 °C trong 30 min tránh ánh sáng).

Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột với liều 0,5 ml/con. Mỗi độ pha tiêm 6 chuột.
Theo dõi kết quả sau 24 h đến 48 h, theo dõi số chuột sống chết trong mỗi độ pha.
Tính kết quả theo công thức Spearman-Karber:

Log LD₅₀ = Xo+d/2 – d x (Σr_i /n)

Trong đó:
Xo là log của nồng độ nọc rắn thấp nhất gây ra chuột chết 100%;
d là log của bậc pha loãng
r_i là số chuột chết của mỗi độ pha loãng;

n là số chuột được tiêm của mỗi độ pha loãng.

LD₅₀ =AntilogLD₅₀

* Xác định hiệu giá huyết thanh kháng nọc rắn:

Chuẩn bị dung dịch nọc rắn có chứa 20 LD₅₀ /ml: Từ dung dịch nọc rắn gốc (1000 µg/ml, giữ ở 2 – 8 °C), pha bằng nước muối sinh lý để có dung dịch chứa 20 LD₅₀ /ml. Chuẩn bị huyết thanh kháng nọc rắn thử nghiệm: Huyết thanh thử nghiệm (không pha loãng hoặc pha loãng 2 lần, 3 lần, 4 lần… trong trường hợp huyết thanh kháng nọc rắn có hiệu giá cao trên 200 LD₅₀ ) được lựa chọn tối thiểu 5 độ pha có nồng độ huyết thanh cách nhau liên tiếp 1,1 hoặc 1,4 lần sao cho sau khi trung hòa với một lượng nọc rắn cố định thì mức nồng độ huyết thanh cao nhất phải bảo vệ được 100 % số chuột được tiêm và mức nồng độ huyết thanh thấp nhất gây chết 100 % số chuột được tiêm.

Trung hòa:
Trong một dãy ống nghiệm, lần lượt cho vào mỗi ống: 2,5 ml dung dịch nọc rắn chứa 20 LD₅₀

Một thể tích thay đổi đã lựa chọn của huyết thanh thử nghiệm. Một lượng nước muối sinh lý để vừa đủ 5,0 ml trong mỗi ống. Lắc nhẹ các ống nghiệm, trung hòa ở nhiệt độ 37 °C trong 30 min, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml/chuột vào tĩnh mạch đuôi. Dùng 6 chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi kết quả sau 24 h đến 48 h.
Tính liều bảo vệ 50 % (ED₅₀)theo công thức Spearman- Karber:

Log ED₅₀ = Xo+d/2 – d_x (Σr_i /n)

Trong đó:

Xo là log của nồng độ huyết thanh thử nghiệm ít nhất bảo vệ được 100 % chuột
d là log của bậc pha loãng;
r_i là số chuột sống của mỗi dung dịch trung hòa;
n là số chuột được tiêm của mỗi dung dịch trung hòa.

ED₅₀ = AntilogED₅₀

* Xác định số LD₅₀ trung hòa (nhóm chứng): Từ dung dịch nọc rắn chứa 20 LD₅₀ /ml pha loãng thành các độ pha 1/20; 1/14; 1/10; 1/7 và 1/5 (nếu xác định số LD₅₀ sử dụng hệ số pha loãng d=1,4), hoặc 1/12,1; 1/11; 1/10; 1/9,1; 1/8,3 (nếu xác định LD₅₀ sử dụng hệ số pha loãng d=1,1) bằng nước muối sinh lý. Lắc nhẹ các ống, để ở 37 °C trong 30 min, tránh ánh sáng. Tiêm 0,5 ml vào tĩnh mạch đuôi cho mỗi chuột. Dùng 6 chuột cho mỗi độ pha. Theo dõi kết quả sau 24-48 h.

Tính số LD₅₀ trung hòa (tính T) theo công thức:

log T = -[Xo+d/2 – d_x (Σr_i /n)]

Trong đó:
X₀ là log của nồng độ nọc rắn gây chết chuột 100%;

d là log của bậc pha loãng,
r_i là số chuột chết của mỗi độ pha,
n là số chuột được tiêm của mỗi độ pha.
* Xác định hiệu giá (hay tính số LD₅₀ có trong 1 ml huyết thanh thử nghiệm):

Hiệu giá = (T – 1)/ED₅₀

Trong đó:

T là số LD₅₀ dùng để trung hòa trong 1 liều tiêm;

ED₅₀ là liều bảo vệ 50%.

Xem thêm: HUYẾT THANH MIỄN DỊCH DÙNG CHO NGƯỜI (Immunosera ad usunt humanum)- Dược điển Việt Nam 5

Tiêu chuẩn đánh giá.

Thử nghiệm xác định hiệu giá chỉ có giá trị khi T nằm trong khoảng từ 4 đến 6. Hiệu giá của huyết thanh thử nghiệm phải không nhỏ hơn 1000LD₅₀ /Iọ.

An toàn chung

Huyết thanh kháng nọc rắn phải đạt yêu cầu về thử nghiệm an toàn chung (Phụ lục 15.11).

Vô khuẩn

Đạt vô khuẩn (Phụ lục 15.7).

Nitơ toàn phần

Không lớn hơn 15 % (Phụ lục 15.18).

Thimerosal

Không lớn hơn 0,01 % (Phụ lục 15.29).

Natri clorid

Từ 0,85 % đến 0,9 % (Phụ lục 15.26).

pH

6,0 đến 7,0 (Phụ lục 15.33).

Đóng gói, bảo quản

Mỗi lọ đóng từ 2,0 ml đến 5,0 ml hoặc dạng đông khô, tùy theo nhà sản xuất. Bảo quản ở nhiệt độ 2 °C đến 8 °C, tránh ánh sáng.